金属蛋白酶ADAMTS13构象及其与血管性血友病因子VWF结合的力学调控机制的研究

The adhesion of platelets to injury site at blood vessel wall is a critical step in hemostasis and formation of thrombosis, which is a multi-step process meditated by various molecules and shear stress. Von Willebrand Factor (VWF) mediates platelets tethering to and rolling on blood vessel wall. The adhesive of VWF relates to its molecular size. A metalloprotease ADAMTS13 cleaves the Tyr1605-Met1606 peptide bond in VWF A2 domain to regulate its size and prevent thrombosis. The binding and proteolysis of ADAMTS13 to VWF therefore have been being the hot topic in the field. However, some disadvantages exist in previous studies, such as the long incubation time far beyond physiological condition, the discrepancy of the function of ADAMTS13 c-termini, et al. Therefore, in this project Atomic Force Microscopy (AFM) and flow chamber techniques will be applied, at single molecular level, to examine the stability of ADAMTS13 conformation, its binding to VWF and extract the kinetic constants in the conditions closer to physiological/pathological scenarios. This project aims to reveal the molecular basis and regulation mechanisms of shear stress on ADAMTS13 conformation and its binding to VWF, in order to further understand to the process of hemostasis and thrombosis, and provide new insight and method in therapeutics.

血小板粘附到血管壁受损处是止血和血栓形成的重要因素，是一个多步骤、受不同分子及剪切应力调控的过程。血管性血友病因子VWF，参与调控血小板在血管壁上的初始粘附及滚动。VWF的粘附性与其分子大小有关。金属蛋白酶ADAMTS13酶切VWF A2结构域的Tyr1605-Met1606肽键，调节其大小，防止血栓的形成。因此，ADAMTS13与VWF的结合及酶切的研究一直以来均为该领域的热点。然而，此前的研究存在着不足，例如，两者的反应时间过长，偏离生理条件；ADAMTS13 C－端结构域的功能尚存争议等。为此，本项目拟采用原子力显微镜及流动腔技术在单分子水平，在更接近生（病）理的条件下，研究ADAMTS13构象的稳定性，及其与VWF结合，并提取反应动力学常数，以揭示ADAMTS13构象及其与VWF结合的分子基础，及应力调控机制，为进一步认识止血和血栓形成的过程，及相关疾病的治疗提供新的视角和思路。

金属蛋白酶ADAMTS13水解VWF，调控其促血栓活性，是防止血栓形成的重要步骤。为了进一步理解野生型及功能增强型ADAMTS13识别和水解VWF-A1A2A3的力学调控机制，我们利用原子力显微镜技术、流动腔技术以及分子动力学模拟技术研究了野生型及功能增强型ADAMTS13的构象状态；不同外力条件下，野生型ADAMTS13及其突变体结合、水解VWF分子的力学调控机制。研究发现：1、ADAMTS13存在多种构象状态，除了已发现的“闭合”和“打开”构象外，还存在着中间构象态；低pH促进ADAMTS13分子构象的进一步延展。2、野生型ADAMTS13通过其C-端CUB结构域结合球形VWF，而通过其N-端TSP7结合延展的VWF；ADAMTS13的TSP7和CUB均存在着与VWF-A1A2A3结合的位点，且这两个结合位点与VWF-A1A2A3的结合呈现截然不同的力学依赖关系；ADAMTS13 spacer结构域与VWF-A2结构域α6螺旋的结合强度随α6螺旋的伸长呈现先增强后减弱的特性。3、野生型及功能增强型ADAMTS13与VWF-A2的相互作用明显强于野生型ADAMTS13与VWF-A1A2A3的相互作用，提示VWF的A1和A3结构域会阻挡A2结构域与ADAMTS13的相互作用。4、ADAMTS13水解VWF-A1A2A3不仅呈现力依赖的双相性，而且呈现双态性。这可能是与ADAMTS13-VWF的结合强度依赖于力及VWF伸展这一特性有关。上述研究成果进一步加深了我们对于ADAMTS13识别、水解VWF的认识，为相关疾病的治疗和新药物的开发设计提供新的思路。在本项目的资助下，发表SCI论文4篇，中文核心期刊1篇，申请发明专利2项，培养硕士研究生5人，顺利完成了项目预期目标。经费使用按预算执行，共支出项目经费的97%。