杨树内生细菌吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007抗病促生机理及工程菌构建

In recent years, biological control is an important method and developing drection in controling plant pathogens. Several endophytic bacteria isolated from plant tissues have been reported to be potential biological control agents against phytopathogens and insects and to increase plant growth and development. Several strains of Burkholderia cepacia complex (BCC) have shown effective ability in suppressing many plant diseases. Here, the high-efficient antagonistic bacterium B. pyrrocinia JK-SH007 with biocontrol activity against the poplar canker will be advantaged. Firstly, the colonizing dynamics, disease resistance and growth effect of this strain will be determined. Secondly, isolation, purification and chemical structure of inhibitory and promoting-growth compounds from strain JK-SH007 will be studied to make known chemical mechanism of biocontrol and promoting growth. Thirdly, the inoculation effect of this strain will be determined to evaluate ecological safety of strain JK-SH007. Study on the genome of B. pyrrocinia JK-SH007 will be carried to unravel the biocontrol mechanisms at the molecular level through next generation sequencing technology and bioinformatic analysis. And, the functional analysis of the genes involved in biocontrol or promoting growth will be carried. Finally, the multi-funcation engineered strain will be constructed to improve biocontrol activity of strain JK-SH007 through genetic transformation of other functional genes.

生物防治是国内外植物病害防治的重要手段和发展方向，应用植物体内的有益内生细菌促进植物生长，提高植株的抗病虫能力已成为近一个时期植物病虫害生物防治研究的热点，其中洋葱伯克氏菌群（Bcc）中许多种类或株系已在国外的一些植物病害生物防治中发挥重要作用。本研究以申请人前期从杨树体内筛选获得的对杨树溃疡病等林木病害有高效生防潜能的吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia pyrrociniaJK-SH007菌株为对象，研究其在杨树体内的内生定殖部位和定殖周期，对杨树等植物的促生抗病效应和稳定性；进行内生细菌促生抗菌物质分离、纯化和化学结构分析，揭示其促生抗病的化学机理；研究其对多品种杨树的接种效应，分析评价其释放于环境后的生态安全性；开展B.pyrrociaJK-SH007全基因组学研究，解析JK-SH007抗病促生功能基因；遗传转化导入其他功能基因，构建具有多种促生抗病抗虫功能的Bcc工程菌株。

生物防治是国内外植物病害防治的重要手段和发展方向。植物内生细菌具有抗病虫害等生防潜力，并对植物生长具有促进作用。洋葱伯克氏菌群（Bcc）中许多种类或株系已在一些植物病害生物防治中发挥重要作用。本研究以前期从杨树体内筛选获得的对杨树溃疡病等林木病害有高效生防潜能的吡咯伯克霍尔德氏菌Burkholderia pyrrocinia JK-SH007（以下简称JK-SH007）菌株为对象，采用GFP标记、Cross Section等方法研究了该菌株在美洲黑杨体内的内生定殖部位和定殖周期，结果表明JK-SH007菌株具有内生性，可长期稳定地定殖于杨树体内；分别用传统培养法、生物化学法、分子生物学等手段分析JK-SH007对杨树根际土壤酶活性的变化以及对根际微生物功能多样性和种群数量、结构的变化，结果表明JK-SH007的引入提高了土壤酶活力，但对根际微生物数量和种群结构的影响较小，这意味着将JK-SH007释放到环境中是安全可行的；开展JK-SH007菌株基因组完成图的构建及相关生物信息学分析，解析抗病、促生功能基因；完成了两个促生相关基因iaaH和gabY基因及抗病相关基因葡聚糖酶基因GL、几丁质酶基因CHi和产消吡咯菌素基因簇prnABCD的克隆和表达，有助于在分子水平揭示JK-SH007菌株的抗病、促生机理；采用化学萃取、硅胶柱层析、凝胶柱层析等技术对JK-SH007菌株产生的抗菌物质进行分离纯化，最终得到了该菌株的两种高效抗菌物质JK-SH007-1#(2)和JK-SH007-1#(3)，为开发新型生物农药提供了资源；JK-SH007菌株的野外应用试验结果表明，JK-SH007菌株对杨树新造林有明显的抗病和促生效果；筛选获得在JK-SH007菌株中稳定表达的pyrG基因，作为内参基因用于JK-SH007菌株中基因表达的定量研究；成功构建了含枯草芽孢杆菌几丁质酶基因的工程菌株JK-SH007E1，其几丁质酶活性及对杨树溃疡病菌的拮抗能力均得到显著增强，且释放到环境中后对杨树根际微生物的影响较小。此外，转Bt基因的JK-SH007工程菌株的构建工作正在进行中。这些研究对JK-SH007菌株及其基因工程菌株在杨树溃疡病生物防治上的推广应用具有重要的理论意义和实践价值。