LKB1激酶调控哺乳动物红细胞脱核的分子机制研究

Mammalian erythroblasts undergo enucleation through a process of asymmetric cytokinesis, in which the nucleus surrounded by the plasma membrane is budded off from the erythroblast to form a reticulocyte. The molecular mechanisms underlying enucleation remains unexplained although it has been discovered for more than a century. LKB1/STK11, a serine/threonine kinase, is the central regulator of cellular asymmetry polarity. According to our RNA-seq data, we found that this gene was significantly up-regulated in orthochromatic erythrocytes. To explore the role of LKB1 in human erythroblast enucleation, we knocked down LKB1 by shRNA in human CD34+ cells and found that LKB1 knockdown resulted in remarkable decrease in enucleation, but not affected cell differentiation and apoptosis. Base on these findings, we hypothesize that LKB1 is a potential regulator of cellular asymmetry in mammalian erythroblast enucleation. In this project, we will deeply characterize the molecular mechanisms by which LKB1 regulated enucleation using flow cytometry, ImageStream, live cell imaging, phosphoproteomics analysis and so on. The successful implementation of the proposed studies will not only be encouraging to uncover the underlying mechanism of mammalian erythroblast enucleation, but also help in developing a strategy for human functional erythrocytes formation in vitro.

哺乳动物红细胞脱核是一个不对称的有丝分裂过程，得到一个含有细胞核及少量胞浆的子代细胞和另一个含有大量胞浆但无核的子代细胞，即脱核红细胞。这一脱核过程虽早已被发现，但其具体机制仍不明确。而肝激酶B1 (LKB1)，又称丝/苏氨酸蛋白激酶11 (STK11)，编码丝/苏氨酸蛋白激酶，是细胞不对称分裂极性的核心调控因子。本课题组红系发育各阶段转录组数据显示其表达水平在晚幼红细胞中显著上调。我们对LKB1在红系发育中的作用进行初步研究，发现敲低人CD34+细胞中的LKB1不影响红细胞分化和凋亡，但显著地降低脱核率。因此我们推测其通过调控细胞不对称分裂进而影响红细胞脱核。本项目拟利用流式细胞术、ImageStream技术、活细胞成像技术和磷酸化组学等多种技术方法深入探索LKB1在脱核过程中的分子机制。项目的完成不仅有助于揭示调控红细胞脱核的分子机制，也为体外生成功能性红细胞提供了新的研究思路。

本课题组已经建立分选CD34+细胞并在体外培养分化的体系，高度模拟从造血干细胞到成熟红细胞的的发育过程。LKB1 作为重要的激酶，在造血干细胞和T细胞的发育中均起到重要作用，但是目前尚无关于 LKB1 在人红系发育过程中的研究。明确LKB1在人红系发育过程中的终末阶段高表达，利用慢病毒携带shRNA介导在CD34+细胞来源的体外红系培养体系中LKB1的敲低，揭示了LKB1在体外培养体系中红系发育过程中的重要功能，LKB1敲低导致红细胞增殖加快、红系祖细胞积累、红系终末分化延迟以及红细胞脱核受阻。使用LKB1敲低组和对照组有核红细胞检测蛋白质组学和磷酸化组学。差异表达蛋白聚类分析结果显示，在LKB1缺乏条件下，胆固醇代谢相关蛋白的表达发生了显著改变，表明LKB1缺失可能造成胆固醇代谢失衡，继而影响红系发育。此外，通过对红系发育早期和晚期的DNA甲基化和转录组数据进行生物信息学分析，明确了4个红系发育基因，验证了DNAJA4的启动子区域的DNA甲基化与基因表达显著负相关，同时敲低DNAJA4在红系终末阶段影响细胞增殖、凋亡和脱核。同时发现DNAJA4和急性髓系白血病的预后相关。DNAJA4在AML中红系发育异常分型中高表达，并和DNA甲基化相关。表明DNAJA4表达由甲基化调控，并在红系发育中有重要功能。DNAJA4的异常表达和红系障碍性疾病相关。本项目的完成为调控红细胞脱核机制提供全新的思路和科学依据，也为相关红系障碍性疾病的防治提供理论依据和潜在靶点。