Bmi-1在防止心血管衰老中的作用及机制研究

To determine whether Bmi-1 deficiency resulted in cardiovascular aging by activating p16-Rb signalling pathway, increasing oxidative stress and up-regulating DNA damage response, subsequently inducing cardiovascular dysfunction, Bmi-1 deficiency mice will be fed a dietary antioxidant N-acetyl-cysteine(NAC) or pyrroloquinoline quinone(PQQ) and double Bmi-1 and p16 or Chk2 mutant mouse models will be generated. Cardiovascular phenotypes will be analyzed and compared each other using histopathological, cellular and molecular techniques, including life span, cell proliferation, apoptosis and aging, proinflammation and profibrosis, cardiovascular function, oxidative stress and DNA damage response, and the expression and regulation of cardiovascular risk factors. Moreover, to determine whether vascular aging caused by Bmi-1 deficiency was direct action, mesenteric artery and common carotid artery of Bmi-1 deficiency mice will be transplanted subcutaneously into immunodeficient mice for observing the effect of microenviromental changes to the phenotype of vascular aging caused by Bmi-1 deficiency. This study will elucidate mechanisms of role of Bmi-1 in preventing cardiovascular aging and maintaining cardiovascular function, thus will provide a novel target and experimental basis for the clinic prevention and treatment of cardiovascular aging associated diseases.

为了明确Bmi-1缺失是否通过激活p16-pRb信号通路，增加氧化应激和上调DNA损伤反应，引起心血管衰老，从而导致心血管功能障碍，我们将给予Bmi-1缺失小鼠补充抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)或吡咯喹啉醌(PQQ)，并建立Bmi-1和p16或Chk2双基因敲除小鼠模型，利用组织病理学、细胞生物学和分子生物学的方法比较分析上述各组动物的心血管表型差异，包括生存期，细胞增殖、凋亡和衰老，促炎及促纤维化反应，心血管功能，氧化应激和DNA损伤反应，心血管风险因子表达及调控；同时，为了明确Bmi-1缺失引起的血管衰老是否为直接作用，将Bmi-1缺失小鼠的颈总和肠系膜动脉移植到免疫缺陷小鼠皮下，观察微环境改变对Bmi-1缺失引起血管衰老表型的影响。本研究将阐明Bmi-1在防止心血管衰老、维持心血管功能中的作用机制，为临床防治心血管衰老相关疾病提供新的靶标和实验依据。

为明确Bmi-1防止衰老相关心血管功能障碍的作用及机制，给予Bmi-1缺失小鼠补充抗氧化剂NAC或PQQ，并建立Bmi-1和p16或p53或Chk2双敲小鼠，观察心血管功能，测定尾动脉血压和脉搏，检测心肌细胞肥大、纤维化、p16表达、衰老相关促炎因子和肾素血管紧张素醛固酮系统(RASS)相关分子表达情况；通过炎症因子抗体芯片比较分析6周龄Bmi-1缺失与WT小鼠血清中40种炎症因子表达，通过酶联免疫吸附测定、流式细胞术和免疫组化分析高表达的IL-1β产生的主要部位及细胞类型；给予2周龄Bmi-1缺失小鼠腹腔隔天注射人重组IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)4周，观察心功能、p16表达、IL-1β阳性面积、CD3或gamma-deltaTCR阳性T细胞在心血管分布；对Bmi-1缺失和WT小鼠的MEFs和胚胎心肌细胞(ECM)，给予重组人的IL-1β和/或IL-1RA，分析p16表达及细胞衰老。与同窝WT小鼠相比，Bmi-1缺失小鼠心血管功能障碍、心肌细胞肥大、RASS活化、血清及心血管组织中促炎症因子分泌增加，其中以IL-1β增加为著，抗氧化剂补充或p16或p53或Chk2敲除能不同程度地改善Bmi-1缺失小鼠上述表现；gamma-deltaTCR+T细胞是胸腺、主动脉中分泌IL-1β的主要细胞；IL-1RA给药明显改善Bmi-1缺失引起的早衰及心功能障碍。Bmi-1通过抑制氧化应激和细胞周期阻滞防止心功能障碍和心肌细胞肥大，延缓以IL-1β升高为特征的炎性衰老来维持心血管功能。为进一步明确Bmi-1在防治病理性心肌细胞肥大中的作用，对Bmi-1缺失和过表达小鼠进行血管紧张素(Ang)II皮下埋泵缓释诱导，并用AngII处理ECM和人心肌细胞AC16，经组织及分子生物学实验发现Bmi-1明显抑制AngII诱导的GATA4依赖的心肌细胞肥大、衰老及炎症；Bmi-1明显促进GATA4自噬降解；自噬激动剂补充下调GATA4依赖的心肌细胞肥大、衰老及炎症的作用在Bmi-1缺失的心肌细胞明显差于野生型；GATA4与Bmi-1-RING1B复合体结合并被泛素化，经p62识别而自噬降解。因此，Bmi-1-RING1B复合体通过结合、泛素化、自噬降解GATA4蛋白，抑制依赖GATA4的衰老相关病理性心肌肥大及炎症并改善心功能。本研究将为临床防治心血管衰老相关疾病提供新的靶标及实验依据。