基于基因多样性分析的堆肥过程中木质纤维素降解微生物群落结构与功能研究

木质纤维素降解是提高堆肥处理效率的限制因素，对其进行深入研究对深刻理解堆肥过程中木质纤维素降解本质、提高堆肥处理效率及进行堆肥工艺革新等具有重要意义。然而人们对堆肥过程中木质纤维素降解的微生物学认识还很肤浅，传统分离培养的方法很难正确估计堆肥过程中木质纤维素降解微生物的多样性。通过变性梯度凝胶电泳分析堆肥中木质纤维素降解功能基因，可以研究堆肥过程中木质纤维素降解微生物种群。本项目拟采用变性梯度凝胶电泳结合克隆文库、荧光原位杂交等分子生物学技术对有机固体废物堆肥过程中木质纤维素降解相关功能基因进行研究，通过分析其中木质纤维素降解功能基因多样性及表达活性研究其中木质纤维素降解微生物的群落结构与功能状态。考察不同堆肥阶段及工艺条件对木质纤维素降解微生物群落、功能基因多样性及表达活性的影响，从本质上解析有机废物堆肥过程中木质纤维素降解的微生物分子生物学原理，为堆肥工艺的革新提供指导。

木质纤维素降解是提高堆肥处理效率的限制因素，对其深入研究对深刻理解堆肥过程中木质纤维素降解本质、提高堆肥处理效率及进行堆肥工艺革新等具有重要意义。木质纤维素降解相关微生物种群和数量可由相应的降解酶功能基因进行表征。本项目针对有机固体废物堆肥过程中木质纤维素降解的相关功能基因进行研究，通过分析其中木质纤维素降解相关功能基因的多样性与表达，解析堆肥过程中木质纤维素降解微生物群落结构与功能状态。首先发明了一种堆肥微生物总DNA的提取与纯化方法及缓冲液；在此基础上又发明了一种研究堆肥中生物酶基因多样性的分析方法；此外还发明了一种检测纯菌种或环境样品中链霉菌two-domain漆酶基因的方法。基于上述研究基础，对农业固体废物堆肥过程中木质纤维素降解酶功能基因的多样性进行了研究。漆酶是参与木质素降解或解聚的三大酶系之一，且其四个铜结合位点在进化过程中表现出了高度的保守性，故而被定为本项目的重点研究对象。本项目分别对农业固体废物堆肥过程中细菌和真菌漆酶基因进行了研究，主要分析其多样性变化、丰度、酶活及其与木质素降解率之间的关系，目前已对堆肥过程中漆酶基因携带菌变化规律及其与木质素降解的关系有了一些初步认识。本项目还对降解酶系中的其他酶基因进行了研究，如木质素过氧化物酶和锰酶，但由于这两种酶各种不同物种间差异性较大，因此虽然课题组设计了简并引物，对实验体系进行了优化，但还是未能得到较好的实验结果。同时，本项目还从堆肥样品中筛选了一些产漆酶的微生物菌株，其中有一株菌的漆酶表现出了较好的热稳定性和耐碱性，这些菌株的获得丰富了农业废物堆肥中木质素降解菌株的多样性，同时为堆肥菌剂及的开发提供了菌株资源。