中药黄芪“显效形式”鉴定与质量评价新模式构建

The quality evalution method of Astragali Radix has not been perfect. In previous research, we found that each constituent of Astragali Radix can produce dozens of metabolites in vivo. We confirmed that some of them have bioactivity and the rest of them may have the bioactivity through bioactivity screening. This research aims to study the establishment of new pattern and new strategy of the quality evalution Astragali Radix. Based on the previous research work, we plan to study the metabolism of total flavonoids and 15 flavonoids constituents respectively in rat in vivo and identify more than 300 kinds of metabolites. And then, we will separate and prepare more than 60 kinds of drug metabolites from urine or feces of minipigs after total flavonoids oral administration. We identify the effective forms (active metabolites) with cardiovascular activity from the metabolites by pharmacological experiments both in vivo and in vitro, and to confirm the original constituents of each effective forms. After oral administration of total flavonoids and 15 flavonoid constituents to animals separately, and we will use LC-QQQ-MS to measure the blood concentration of their effective forms when their cardiovascular effect is exerted. We will compare the intensity of their effect of each effective form in vitro . On the basis of confirming the species number, origins, blood concentration and efficacy contribution of effective forms, we will build the new model to evaluate the quality for Astragali Radix ,which is on the base of the important effective forms and their original constituents.

黄芪质量评价法尚不完善。我们前期发现黄芪每种成分进入体内均可产生数十种代谢产物，其中一些代谢产物具有生物活性，而其余代谢产物经活性筛选亦有可能被发现具有活性。本项目旨在研究构建黄芪质量评价新模式和新策略。在已有研究基础上，拟对黄芪总黄酮及15种黄酮成分分别进行大鼠体内代谢研究，鉴定代谢产物300种以上；给小型猪灌胃黄芪总黄酮，从含药尿或粪中分离制备代谢产物60种以上。用体内外实验筛选代谢产物中具有心血管活性的显效形式（活性代谢产物）明确各个显效形式都来源于哪些原形成分。用液质仪测定黄芪总黄酮和15种黄酮类成分分别灌胃给药后发挥心血管药效时相应各种显效形式的血药浓度；用体外实验比较各个显效形式药效强弱。在明确显效形式的种类、成分来源、血药浓度和药效贡献的基础上，以有意义的显效形式及其原形成分为基础构建黄芪质量评价新模式。

本项目基于黄芪黄酮类成分体内“显效形式”和“叠加作用”研究，构建了更加科学合理的黄芪质量评价新模式。我们提出从体内“存在形式”中确定 “显效形式”研究思路。分别对黄芪7种主要黄酮类成分和总黄酮进行体内代谢研究，鉴定了500余种代谢产物和55种原形成分（可吸收成分），从而阐明了黄芪黄酮类成分的体内存在形式。选取与心肌保护作用密切相关的雌激素受体ERβ为对象，研究了黄芪总黄酮及其23种体内存在形式（包括9种原形成分，8种代谢产物，6种既是原形成分又是代谢产物）的ERβ激活作用。在确证黄芪总黄酮有效的前提下，对23种体内存在形式进行ERβ激活作用研究。结果发现染料木素、染料木苷、槲皮素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷、芒柄花素-7-O-硫酸酯、大豆苷元、大豆苷元-7-O-硫酸酯、雌马酚、鹰嘴豆芽素、黄芪紫檀烷、黄芪紫檀烷苷、二氢染料木素、山柰酚和异鼠李素等17种体内存在形式具有ERβ激活作用，由此确定它们为黄芪黄酮类化合物通过ERβ发挥心肌保护作用的“显效形式”。选择12种“显效形式”开展ERβ激活叠加作用研究，结果表明2种化合物之间可产生叠加作用，4种化合物之间可产生叠加作用，12种化合物之间亦可产生叠加作用。12种化合物中不论是具有强的、中等的，还是具有弱的ERβ激活作用的化合物均可产生叠加作用。该研究结果表明，可作用于相同靶点的化合物，其血药浓度是可以加和的，其活性作用是可以在相同靶点上加和的。该成果表明中药可通过众多的微量存在的药效物质（包括原形成分和代谢产物）浓度及活性的叠加作用而发挥药效，这是中药药效物质及作用机制研究的一项重要突破。由此可解释为什么中药药效物质在体内血药浓度很低，但中药却可在临床应用中发挥治疗效果。通过代谢溯源分析，我们发现上述17种显效形式可来源于黄芪中36种原形成分。因此我们提出黄芪质量评价全新策略：至少应该控制这17种“显效形式”的36种可能来源成分的含量以确保黄芪质量。并提出当前宜通过控制黄芪总黄酮的含量来控制黄芪质量的评价模式。