SIRT1介导骨骼肌细胞自噬促进血管生成改善慢性下肢缺血的机制研究

Therapeutic angiogenesis is a hot topic in chronic lower limb ischemia, with main focus on angiogenesis itself, whereas skeletal muscle, the budding environment of the neovascularization, gains little attention. Late studies suggested that autophagy plays an important role in chronic ischemic injury of the heart and brain, but the changes of autophagic flux and its postive or negative regulation depend on the severity of ischemia and different organs and tissues. Our recent preliminary experiments suggest that under hypoxic conditions, expression of autophagy related protein and secretion of VEGF in skeletal muscle cells increased, accompanied with increased apoptosis of skeletal muscle cells; in animal models, intramuscular injection of autophagy enhancer SIRT1, limb perfusion elevated, while skeletal muscle apoptosis decreased. Since the role of skeletal muscle cells autophagy in chronic lower limb ischemia is not yet reported, we intend to monitor the autophagic flux by Ade-GFP-LC3 and GFP-LC3 transgenic mice, to confirm that autophagy is an important protective mechanism of ischemic skeletal muscle, and to explore with adenovirus interference system and pathway inhibitors that if SIRT1-mTOR-VEGF pathway enhances skeletal muscle autophagy and angiogenesis, which constitutes a positive feedback loop to reduce lower limb ischemia injury. This project aims to elucidate the mechanism of how SIRT1 increases angiogenesis through autophagy of skeletal muscle cells, and to explore new therapeutic target for lower extremity ischemia injury.

治疗性血管生成是慢性下肢缺血的研究热点，血管生成本身是焦点，而骨骼肌作为新生血管的萌芽环境，少受关注。近年研究表明，自噬在心脑慢性缺血损伤中起重要作用，其增减及正负调控因缺血严重程度以及组织器官差异而不同。我们近期预实验显示：缺氧骨骼肌细胞自噬相关蛋白表达上调，VEGF分泌增多，伴随凋亡增加；小鼠缺血肢体注射SIRT1增强自噬，血流灌注增加，骨骼肌凋亡减少。基于目前尚无骨骼肌细胞自噬在慢性下肢缺血中作用的研究报道，本项目拟在前期研究基础上，利用GFP-LC3腺病毒载体和GFP-LC3转基因小鼠监测自噬流，证实自噬是保护缺血骨骼肌的重要机制；并运用腺病毒干扰系统及相关通路抑制剂等，研究SIRT1-mTOR-VEGF通路可否促进骨骼肌细胞自噬和血管生成，进而形成正反馈调控环路，减轻下肢缺血损伤。本项目旨在阐明SIRT1通过骨骼肌细胞自噬促进血管生成的机制，为减轻下肢缺血损伤提供新的治疗靶点。

我国外周血管疾病发病率逐年上升，但目前的促进血管生成治疗远未成熟，仍需要进一步研究慢性下肢缺血的损伤机制。根据我们前期的发现，我们推测：SIRT1通过调控自噬流，抑制血管内皮FOXO1促进血管新生，改善慢性下肢缺血。本项目旨在阐明激活SIRT1调控慢性下肢缺血的机制，为减轻慢性下肢提供新的干预靶点。.由于诱导C2C12细胞系（肌原细胞）分化为成熟骨骼肌细胞实验体系不够稳定，难以开展体外实验，我们决定进一步研究血管内皮细胞（人脐静脉内皮细胞HUVEC）的直接血管新生过程。现已完成主要研究内容有：1) 证实慢性下肢缺血情况下血管新生是保护肢体的重要生理学行为；2) 证实SIRT1激活自噬流明显改善小鼠下肢慢性缺血；3）证实激活SIRT1进而抑制FOXO1可有效增强血管内皮增殖迁移。.重要结果、关键数据：1) 成功构建了慢性下肢缺血小鼠模型，我们发现骨骼肌间微血管新生系下肢缺血缓解的重要病理生理过程；2)利用无糖培养基+2%低氧环境，成功构建血管内皮细胞慢性缺氧缺糖模型模拟慢性下肢缺血；3)我们发现在慢性缺血情况下，骨骼肌自噬明显受阻，而利用白藜芦醇激活SIRT1后，自噬流增强，并血管内皮细胞增殖迁移能力明显增强；4）在小鼠腓肠肌及体外HUVEC中，我们发现在慢性缺氧条件下FOXO1明显上调，而加用白藜芦醇激活SIRT1后该因子显著下调；5）利用FOXO1特异性抑制剂AS1842856干预血管内皮细胞，结果证实FOXO1的下调可明显增强血管内皮细胞在缺氧缺糖条件下的增殖迁移。.科学意义：治疗性血管生成是慢性下肢缺血的研究热点，但仍然缺乏切实有效的治疗手段。本项目通过研究SIRT1在慢性下肢缺血中的作用，证实了慢性下肢缺血时骨骼肌自噬流受阻，而激活SIRT1可增强自噬流，对下肢缺血损伤有明显影响，并进一步证实了激活SIRT1抑制FOXO1可有效增强血管增殖迁移，对慢性下肢缺血有明显的改善作用。我们从SIRT1出发，深入研究其在慢性下肢缺血损伤中的机制，希望发掘有效促进血管生成减轻慢性下肢缺血损伤的新方法，从而改善我国慢性下肢缺血患者的预后，具有重要的临床价值和社会效益。