运用荧光探针技术研究血管内皮生长因子B在小鼠胰岛素分泌信号通路中的作用

Mouse blood glucose is normally kept within a narrow range, which is crucial for maintaining the steady state of the environment. The only hypoglycemic hormone insulin plays an important role in the regulation of blood glucose steady. In the study of vascular endothelial growth factor-B (VEGF-B) knockout mice, the plasma glucose level was significantly higher than that in control mice, and VEGF-B receptor inhibitor significantly reduced glucose-induced insulin oscillations in pancreatic cloned MIN6 cells by with real-time insulin secretion monitoring probe and total internal reflection fluorescence microscopy. Therefore, this project is to clarify the mechanism of VEGF-B in regulation of insulin secretion signal pathway at both the animal model level and islet single cell level, by using VEGF-B knockout mouse and hyperglycemic mouse together with phosphatidylinositol (PIP2), phospholipase C-γ1 (PLCγ1), ring (CAMP) and calcium ion fluorescent probes. With the result, the project will investigate the potential of VEGF-B as a novel target for keeping blood glucose steady in mouse.

小鼠血糖平衡是保持机体内环境稳态的重要条件，唯一具有降血糖功能的胰岛素在小鼠血糖平衡调节中起至关重要作用。申请人前期研究发现，血管内皮生长因子B(Vascular endothelial growth factor-B, VEGF-B)基因敲除小鼠血浆葡萄糖浓度较正常小鼠明显增高，结合申请人团队前期构建的胰岛素分泌实时监测探针和全内角反射荧光显微镜技术，又在胰岛MIN6克隆细胞中发现VEGF-B受体抑制剂明显降低葡萄糖诱导的胰岛素实时分泌。因此，本项目以VEGF-B敲除小鼠和高血糖小鼠为研究对象，通过监测胰岛素和其分泌中起关键作用的磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)、磷脂酶C-γ1(PLCγ1)、环磷酸腺苷(cAMP)及钙离子等的实时定量变化，首次在小鼠整体水平及胰岛单细胞水平深入研究VEGF-B在小鼠胰岛β细胞胰岛素分泌信号通路中的作用机制，将对后续胰岛素及血糖平衡调节机制研究奠定理论基础。

2型糖尿病是胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损引起的一类代谢性疾病，已成为当前世界各国共同面对的公共健康问题。血管内皮生长因子B(Vascular endothelial growth factor-B, VEGF-B)可影响胰岛素分泌信号通路中钙离子(Ca2+)和环磷酸腺苷(cAMP)的含量，进而在胰岛素分泌中起到关键作用，有望成为维持血糖平衡的重要调控点。因此研究VEGF-B在胰岛素分泌信号通路中的作用机制，探究VEGF-B在血糖平衡调节中的作用对于糖尿病的预防和治疗具有重大意义。首先在细胞水平上，以小鼠胰岛β细胞MIN6细胞系为研究对象，采用给予外源性VEGF-B蛋白刺激的方法上调VEGF-B的表达，以及siRNA方法降低VEGF-B的表达，通过检测细胞增殖能力和凋亡能力判断VEGF-B对MIN6细胞活力的影响。接着用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）检测胰岛素、Ca2+和cAMP水平变化，蛋白免疫印迹（Western Blot）检测胰岛素分泌信号通路中关键蛋白分子PLCγ1、PI3K、AKT等的表达变化。动物水平上，构建全身性敲除VEGF-B小鼠模型（VEGF-B-/-），检测小鼠的体重，血糖，胰岛素，胰高血糖素，糖化血红蛋白及腹腔葡萄糖耐量（IPGTT）、腹腔胰岛素耐量（IPITT）变化。并进行胰岛分离培养，在体外检测VEGF-B-/-小鼠的离体胰岛细胞团在葡萄糖刺激下的胰岛素及胰高血糖素分泌水平。通过细胞水平的验证，发现外源性VEGF-B蛋白的刺激抑制了MIN6细胞的胰岛素分泌，并且胰岛素分泌信号通路中的Ca2+、cAMP含量减少，PLCγ1、PI3K、AKT等蛋白的表达减弱；siRNA敲降VEGF-B后，MIN6细胞的胰岛素分泌和细胞内Ca2+、cAMP含量均增加，并且PLCγ1、PI3K、AKT等蛋白表达上调。动物水平的实验结果发现，与野生型（VEGF-B+/+）小鼠比较，VEGF-B-/-小鼠的体重没有明显变化，血糖水平降低，胰岛素分泌增加，IPGTT增加，IPITT无明显变化。综合上述结果，本研究为探讨VEGF-B在血糖平衡调节中的作用及其对糖尿病的预防和治疗的机制奠定了坚实的基础。