蓝藻异形胞分化主调控因子HetR和PatS的相互作用机制

Anabaena sp. PCC 7120 is a filamentous cyanobacterium that can form heterocysts for nitrogen fixation when deprived of combined nitrogen. Heterocyst development is a complex process, involving many genes and signal molecules. HetR, the master regulator of heterocyst development, is a serine-type protease exhibiting DNA binding activity. PatS is a key negative regulator of heterocyst differentiation, whose C-terminal residues RGSGR(or ERGSGR) interact with HetR, preventing it from binding to specific DNA targets. Recently the crystal structures of complexes comprised of HetR with DNA targets were reported. Based on these structures, we are planning to do some research on the relationship between HetR and PatS in the following two ways: First, use DNA footprinting to define the binding site for HetR on the upstream of hetR and patS gene, study on the mechanism that how HetR binds to DNA in a sequence-independent manner, so as to refine the model of the HetR regulon. Second, model the RGSGR pentapeptide into the HetR structure, identify some candidate sites on HetR to which RGSGR binds would interfere with DNA binding. Then build amino acid substitutions in HetR to verify these probable binding sites.

Anabaena sp. PCC 7120是一类丝状蓝藻，能分化异形胞进行生物固氮。研究发现，异形胞分化调控网络由许多基因和信号分子构成，其中HetR是最主要的正调控因子，它是一个具有DNA结合活性的丝氨酸蛋白酶；而PatS是关键的负调控因子，其C末端的多肽序列RGSGR(或ERGSGR)能抑制HetR与DNA结合。基于申请人前期得到的HetR蛋白的晶体结构，本项目拟从以下两方面进一步研究HetR与PatS之间的相互作用机制：一方面，定位HetR在hetR、patS基因上游的结合位点，研究HetR与DNA非序列特异性结合的规律，以完善HetR蛋白的转录调控子模型；另一方面，基于HetR蛋白结构预测PatS在HetR上与DNA构成竞争关系的结合位点，通过在这些位点构建氨基酸替换突变来验证预测的准确度，从而从分子水平深入探索PatS对HetR转录因子活性的抑制作用机制。

Anabaena sp. PCC 7120(以下简称Anabaena 7120) 在培养基中缺乏固定态氮的情况下，会在菌丝中分化出异形胞用于进行固氮作用。异形胞分化过程有明显的格式形成，一直以来研究者们认为这种格式形成是可以用图灵模型来解释的：转录因子HetR是模型中的激活子，而PatS是模型中的抑制子。本研究即探索两者之间的作用机制，我们在HetR上搜寻了PatS的结合位点，探索了另一转录因子PatA对HetR和PatS相互作用的影响。通过EMSA实验，我们发现PatA可以消除PatS对HetR结合DNA活性的抑制作用，而这种消除效应并不是通过蛋白酶降解来实现的。在Anabaena 7120减氮过程中，PatA的表达量会逐渐下降。我们认为这一发现可以为异形胞分化的图灵模型引入第三个因子，从而可以完善该模型。PatA消除PatS抑制作用的分子机制，还有待进一步研究。