针对昆虫几丁质酶催化中间过程的实验探究和抑制剂开发

Epidermal chitinases are indispensable for Insect molting. Therefore, they are ideal targets for insect growth regulators design. Insect chitinases belong to glycoside hydrolase 18 family, which employs the substrate-assisted retaining mechanism. However, so far there are no direct experimental evidences for elaborating the dynamic conformation changes during the catalytic process, which hinders the development of potent inhibitors based on the catalytic mechanism. Using the group II chitinase from Ostrinia furnacalis (OfChtII) as a model, we have obtained about fifty enzyme-substrate complex crystals by changing the reaction condition or soaking time, and captured an intermediate conformation during the enzymatic hydrolysis. In this proposal, we will use structural biology approaches to observe the dynamic structural information in the catalytic process of OfChtII, such as the reaction transition state and intermediate. Based on the structural information, we will develop potent inhibitors of OfChtII by rational design and virtual screening. Then we will try to obtain the enzyme-inhibitor complexes to study the specific sites of interactions between enzymes and small molecules. Finally, the inhibitors will be optimized to obtain compounds with application prospects as a structural starting point for growth regulators development. The expected outcomes will provide the core information for developing novel pesticides that target at insect chitinases.

表皮几丁质酶对于昆虫蜕皮过程不可或缺，是昆虫生长调节剂设计的理想分子靶标。该酶属于糖基水解酶18家族，遵循底物辅助保留催化机制。但对于其催化中间过程的构象一直没有获得实验的证据，极大限制了基于催化机理的抑制剂的开发以用于干扰害虫生长发育。以鳞翅目害虫亚洲玉米螟II分支几丁质酶(OfChtII)为模型，申请人前期通过改变酶与底物的反应条件以及孵育时间，已获得50多个底物与酶的复合物晶体，并捕获了水解过程中的一个中间构象。基于这些基础，本项目拟通过结构生物学方法获取OfChtII催化过程中的反应过渡态和中间体等动态结构信息，通过虚拟筛选结合理性设计获得高效的抑制剂；最后，通过获得酶与小分子的复合物晶体结构研究二者相互作用的特异性位点，并优化化合物结构以获得具有应用前景的化合物作为昆虫生长调节剂开发的结构起点。项目预期成果将为新型杀虫剂的理性设计和筛选提供核心分子基础。

几丁质酶参与昆虫蜕皮、线虫卵孵化等重要生理过程，对其生长发育至关重要，因此几丁质酶的抑制剂可以用于杀虫剂和杀线虫剂的开发，然而目前可应用于农业生产的几丁质酶抑制剂较少。本项目以几丁质酶催化反应过渡态和中间产物等结构为起点，结合活性口袋的形状和带电性等特征去进行了几丁质酶抑制剂的筛选、开发和改造，获得了多种高效的新型几丁质酶抑制剂。主要成果包括：（1）设计开发了小檗碱骨架的新型几丁质酶抑制剂，对细菌、昆虫以及人来源的多种几丁质酶均表现出良好的抑制活性，通过复合物晶体结构阐明了抑制机理，进一步开发出了活性更高的小檗碱衍生物，其中化合物4c对SmChiB、OfChtI、HsCht和hAMCase的Ki分别为0.15μM、3.03μM、0.35μM和0.80μM；（2）解析获得了首个线虫几丁质酶CeCht1的晶体结构，并基于结构特征筛选获得了BP和PP两个系列的新型抑制剂，通过复合物晶体结构和分子对接揭示了抑制剂的结合模式，进一步筛选获得了活性更高的化合物PP28，Ki值为0.18µM；（3）对GH18家族几丁质酶和靶向昆虫几丁质酶的农药的研究进展的研究进展进行了全面综述，对其中存在的问题进行了重点介绍，并对该领域未来的研究方向提出了展望。项目成果为靶向几丁质酶的新农药开发提供了分子基础和结构起点。