新型骨髓间充质干细胞NG2+/BmMSCs亚群向胆管细胞定向分化功能鉴定及其分子调控机制研究

Stem/progenitors for tissue repair, engineer and regeneration is a hot area in the field. However, underlining of their heterogeneity and control factors for functional differentiation is still challenging. We have previously identified a NG2-expressing cells from marrow mesenchymal stem cells (NG2+/BmMSCs) that exhibite a cholagiocyte progenitor activity and have better therapeutic effect than those of NG2 negative in marrow (NG2-/BmMSCs) and liver-derived NG2- cells (NG2+SPCs) in chronic cirrhotic condition. Thus effect is negatively regulated by HGF signaling pathway and its downstream unique transcription factors. This suggests NG2-/BmMSCs might be a novel bile duct stem/progenitors and advanced functional stem cell source in chronic pathological conditions. Therefore, in this application, we hypothesized that NG2+/BmMSCs as novel cholangiocyte progenitors might initiate chronic liver regeneration through HGF/cMet-HNF3α-HNF4β-Lgr5 axis in chronic injured liver niche by differentiate into functional cholangiocytes. Demonstration of the concept will provide a new theory and improve therapeutic efficacy in the near future clinic.

背景：干细胞的组织修复和再生是当前治疗终末期器官功能障碍的研究热点，其中干细胞异质性和分化调控因素仍是需要解决的难题。我们前期预实验采用原创方法首次发现骨髓来源的新型干细胞亚群（NG2+/BmMSCs）具有独立胆管细胞分化优势，其治疗慢性肝损伤效果明显优于同体NG2-/BmMSCs 和肝脏来源的NG2+阳性细胞。尤其在严重肝损伤病理条件下NG2+/BmMSCs很可能是优越性干细胞来源。据此，本研究将证明负向调控损伤微环境中HGF信号通路调节其下游特异分子HNF3α-HNF4γ-Lgr5轴通路可启动NG2+/BmMSCs介导的慢性肝再生”这一科学假设。.主要研究内容：（1） NG2+/BmMSCs生物学特性鉴定；（2）肝损伤环境HGF信号通路调控下的胆管细胞分化和功能比较；（3）疗效评估。.重要结果：（1）证明骨髓中存在功能性胆管祖细胞功能亚群（NG2+/BmMSCs），在慢性肝损伤环境下分化为大量修复性胆管细胞并受HGF信号通路的负向调控；（2）在慢性肝损伤环境下NG2+/BmMSCs具有优于与其它组织类同干细胞的治疗效果，以此提供治疗性干细胞和提升现有BM-MSCs疗效。.关键数据：（1）获取生物学特性比较数据（NG2+/BmMSCs-NG2-/BmMSCs） ；（2）获取NG2+/BmMSCs胆管细胞功能分化和提升疗效比较数据（BmMSCs-肝脏NG2+细胞; NG2+/BmMSCs-NG2-/BmMSCs）；获取NG2+/BmMSCs在慢性肝损伤环境下干性和功能特性受慢性肝损伤微环境HGF信号通路负向调控数据；（4）从人类BM-MSCs中获取NG2+细胞功能亚群；.科学意义：证明本设想有助于丰富干细胞功能和调控机制的理论体系，并为慢性肝病干细胞疗效提升提供新的理论依据。

项目背景：骨髓间充质干细胞（BmMSCs）异质性是影响终末期肝病(ESLD)临床疗效的关键，如何解决BmMSCs等干细胞临床治疗失代偿期肝硬化或终末期肝病(ESLD)生存期短和疗效难以持久的问题是本项目核心。主要研究内容：本项目拟采用具有自主知识产权方法(发明专利ZL201210426637.8)[张等2016]和自建的与人类ESLD演变发展相类似的二乙基亚硝胺(DEN)诱导的小鼠肝纤维化/肝硬化小鼠模型(DEN-ESLD)[谭等2015]尝试从BmMSCs中分离培养新型亚群(NG2/BmMSCs)以提升疗效，探讨NG2/BmMSCs治疗ESLD优势机制。重要结果：1)采用该方法成功从BmMSCs中成功分离培养了NG2/BmMSCs亚群，对比BmMSCs，NG2/BmMSCs显示治疗DEN-ESLD优势；2)NG2/BmMSCs亚群显示增殖、胆管(BECs)[待发表]和肝窦(LSECs)向分化优势；3)率先发现BmMSCs干细胞治疗DEN-ESLD新机制，即精准靶向ESLD微环境中肝细胞生长因子(HGF)亚基链(ɑ/β)信号及下游亚基信号通路(cMetɑ/β)是解决BmMSCs等干细胞生存期短疗效难以持久问题的关键分子靶点；4)重要的是，我们发现了临床数据与DEN模型的类似趋向性。关键数据及其科学意义：1) 该方法解决了目前学术界从实体器官组织分离培养成体干细胞的局限[Zhang et al 2022]，治疗ESLD优势提示提升BmMSCs临床疗效；2)发现NG2/BmMSCs亚群胆管向细胞(BECs)分化能力优于亲本BmMSCs甚至肝脏来源的干细胞(MLpvNG2+cells)。在2D/3D培养环境中，NG2/BmMSCs显示向BECs和血管内皮细胞( ECs)分化优势，介于肝血窦是由特殊ECs构成(LSECs),提示NG2/BmMSCs通过重构胆道和窦状系统治疗ESLD优势; 3)在DEN-ESLD模型显示，在肝稳态/肝纤维化/硬化/肝癌演变发展过程中，其微环境中HGF亚基(ɑ/β)链动态变化与BmMSCs等干细胞生存和凋亡相关性，结合Zarnegar等报道，我们率先推测肝硬化微环境中两条HGFɑ、β链新型通路调控修复干细胞生存与凋亡以决定ESLD预后，临床意义重大，国内外尚无报道; 4)该原创方法适合人类NG2/BmMSCs亚群提存，我们在几例人类肝硬化。