大白菜抗根肿病基因CRb的分离克隆及其功能鉴定

根肿病是由根肿菌属芸薹根肿菌侵染引起的一种世界性土传病害。根肿菌专性寄生于芸薹属和拟南芥等十字花科植物的根部。该病已严重危害了我国芸薹属作物，特别是大白菜等芸薹种作物的栽培生产。因此，发掘抗根肿病基因，培育抗病品种是降低病害损失的安全有效途径。抗病基因是植物-病原菌相互关系中的一个关键因子，是抗病机制研究的基础。但抗根肿病基因的克隆及其机制研究尚属空白。项目申请人前期对抗根肿病基因之一'CRb'进行了定位，并发现该基因位于大白菜A3连锁群已知序列的150kb范围内。该基因表现为单基因显性遗传，并对根肿菌具有生理小种专化性。本项目拟在利用图位克隆技术分离克隆CRb基因的基础上诠释其结构特点，通过转基因验证和时空表达分析研究CRb基因的功能，并通过构建CRb基因的系统进化树研究该基因的进化关系。该研究结果不仅对进一步揭示CRb 的抗病机制奠定基础，也为大白菜等芸薹属作物的抗病育种提供理论基础。

根肿病是严重威胁大白菜等芸薹属作物生产的主要病害之一。本项目在前期完成大白菜抗根肿病基因CRb的初步定位基础上，通过图位克隆技术对该基因进行了克隆和功能验证。结果总结如下：①以易感根肿病的青梗菜自交系‘702-5’和含CRb的大白菜DH系‘CR Shinki’为亲本，以感根肿病大白菜自交系‘BJN3-2’与含有CRb的近等基因系‘CR BJN3-2’为亲本，分别构建了2个F2群体；②通过精细定位，将CRb定位于大白菜A3连锁群0.07 cM区域内。该区域包括CRb的2个侧翼标记TCR79和TCR108，以及与CRb位点共分离的3个标记；③基因预测结果，该区域含有2个编码TIR-NBS-LRR的基因，并确定为候选基因，分别命名为CRb1和CRb2；④RACE法克隆候选基因，CRb1和CRb2基因的全长cDNA分别为3630 bp和3669 bp。2个候选基因的蛋白结构在抗病与感病材料间存在氨基酸的插入、缺失或替换；⑤测序结果表明，CRb1和CRb2仅存在于芸薹属A基因组。系统发育分析发现，供试的19份抗根肿病芸薹种植物含有与CRb1和CRb2高度同源的序列；⑥拟南芥转基因植株的抗病性鉴定结果，CRb1和CRb2均对根肿病表现出抗病；⑦通过基因表达分析发现，CRb1和CRb2在根肿菌处理后的叶片、叶柄、下胚轴、根中出现了差异表达，尤其根部在接菌后的72小时和9天表现出特异性表达；⑧利用大白菜根肿病抗感近等基因系‘BJN3-2’与‘CR BJN3-2’进行转录组测序，共获得1875个上调基因和2103个下调基因，差异表达基因主要集中在信号转导，对环境刺激的应答以及植物与病原菌的互作。大白菜抗根肿病基因CRb1和CRb2的克隆，为进一步研究根肿病抗性机理和抗根肿病育种奠定了基础。