具E3连接酶活性和U-box结构域的簇毛麦CMPG基因在抗病中的作用机理分析

泛素化介导的蛋白质降解途径在植物抗病信号传导中发挥重要作用，26S蛋白酶体降解防卫信号的活化或抑制因子，导致植物产生对病原菌的感病或抗病性。在拟南芥等植物中相继克隆了具E3泛素连接酶活性和U-box结构域的CMPG基因，作为重要调控基因对提高植物广谱抗病性有重要价值，但目前U-box类基因在植物抗病中的作用机制尚不明了。本实验室在携带广谱高抗小麦白粉病基因Pm21的簇毛麦中克隆了具U-box结构域的Hv-CMPG基因，体外表达验证其具E3连接酶活性，RT-PCR和瞬间表达表明该基因在小麦抗白粉病中发挥作用。本项目将利用转基因技术评价其在小麦抗病改良中潜在应用价值，利用酵母双杂交鉴定其可能的作用底物，揭示Hv-CMPG与小麦抗病通路中关键元件间的关系，探明其作用的分子机制和利用途径，为小麦转基因育种提供基因资源，为探索更安全有效的病害防治新方法开辟新思路。

来自簇毛麦的Hv-CMPG基因编码一个参与泛素-26S蛋白酶体通路中的E3连接酶,在抗白粉病反应中发挥重要作用。本研究发现Hv-CMPG在体外具有E3结合酶活性，参与泛素化反应，在携带广谱、高抗白粉病基因Pm21的小麦品种南农9918中阻断泛素-26S蛋白酶体通路可以提高其感病性。Hv-CMPG基因受白粉菌诱导后在叶片中特异上调表达，其表达主要受SA和ABA诱导上调，推测其通过SA介导的信号通路参与抗白粉菌反应，ABA在抗病信号分子传递中可能发挥作用。利用单细胞瞬间表达体系研究发现，Hv-CMPG在扬麦158叶片中瞬间表达未能显著降低吸器指数，而前期克隆的Pm21关键成员Hv-Stpk能够显著降低吸器指数，推测Hv-CMPG基因与STPK-V基因在抗白粉病中的作用机制不同；分别于2009和2011年利用基因枪方法与pAHC共转化中感白粉病的小麦品种扬麦158，共获得2个稳定的抗白粉病转基因T2代家系，鉴定出抗白粉病转基因T0阳性植株。在T2代抗白粉病家系中，目的基因表达受白粉菌诱导上调，其中的PR1基因表达诱导后也显著上调；利用稳定的抗白粉病转基因T2代株系研究Hv-CMPG基因抗白粉病的作用机制发现，在白粉菌侵染早期，过量表达Hv-CMPG基因的T2代转基因植株中表皮细胞活性氧的积累量高于对照扬麦158，推测Hv-CMPG基因介导的白粉病抗性反应中，活性氧的积累发挥一定的作用；侵染后期，转基因T2代植株中还会通过减少菌丝生长和扩展提高了对白粉病的抗性，蛋白质交联的提高也有助于转基因植株提高对白粉菌的抗性。构建了簇毛麦酵母双杂交文库，通过筛选该文库鉴定出17个Hv-CMPG的互作蛋白cDNA，克隆了其中一个编码法尼半胱氨酸蛋白基因的全长，发现该基因也受白粉病诱导快速上调表达，与Hv-CMPG相同，其亚细胞定位于细胞质和细胞核中，但二者的互作特异地发生于细胞核中。利用基因枪法共转化扬麦158获得阳性转基因植株，发现均表现高抗白粉病，其中的目的基因与转基因受体和阴性植株相比均不同程度上调表达。本项目全面完成了预定的研究内容，达到了预期目标，研究结果为进一步阐明簇毛麦抗白粉病的分子机制奠定了坚实的基础。通过项目研究，形成了有自主知识产权的研究成果，获批和申请专利各1项。