椎间盘退变微环境介导的人髓核间充质干细胞的“静默”作用及其机制探讨

Intervertebral disc (IVD) degeneration is the pathological basis of the spinal degeneration disease. Previous studies has showed that IVD was a non-regenerationable tissue. However, the newest studies had confirmed that degenerated nucleus pulposus also contained the stem cells which could differentiate into like-nucleus pulposus cells. Thence, why the NP-MSCs could not maintain homeostasis within the IVD during the process of degeneration? So far, there has no related researches to explore the reasons. The microenvironment in degenerated IVD has huge difference compared with normal IVD. In degenerated IVD, the microenvironment is hypoxia, low nutrition, low pH and high osmotic. Previous studies had demonstrated that all the above conditions had significant effect on the bioactivities of BMSCs, and the BMSCs and NP-MSCs had extremely similar biological properties. Therefore, we speculate that the microenvironment of the degeneratd IVD also has very important effect on the NP-MSCs, and the microenvironment may be an important factor which causes the NP-MSCs keep silence. Thence, this study are designed to observe the effective of the hypoxia, low nutrition, low pH and high osmotic on the bioactivities of human NP-MSCs in vitro and in vivo, and to explore the possible mechanism based p16INK4a-Rb pathway. This study would not only provide a new concept of the pathogenic mechanism in intervertebral disc degeneration, but also provide a novel therapeutic strategies for the degenerated IVD.

椎间盘退变是脊柱退行性疾病的共同病理基础。既往研究认为髓核组织不可再生，最新研究表明退变的髓核组织内同样存在可向类髓核细胞分化的髓核间充质干细胞（NP-MSCs）。那么，在椎间盘退变过程中NP-MSCs为何不能向髓核细胞分化以延缓或阻止其退变？迄今未见报道。椎间盘退变后微环境会发生重大改变，呈低氧、低营养、高渗和低pH状。研究表明，微环境的改变会抑制BMSCs增殖分化，而NP-MSCs与BMSCs具有相似生物学特性。因此，我们提出假设：微环境的改变可能是内源性NP-MSCs保持“静默”的重要原因。为证实此假设，本课题拟：1）体外观察不同微环境对NP-MSCs的生物学活性的影响；2）通过动物实验观察不同退变程度椎间盘内微环境对NP-MSCs的生物学活性的影响；3）基于p16INK4a-Rb信号通路探讨其作用机制。本研究将为椎间盘退变的病因学提供新理念，为椎间盘退变的防治提供新思路和新靶点。

椎间盘退变是脊柱退行性疾病的共同病理基础。目前临床以对症治疗为主，而非针对椎间盘退变的过程进行干预，其最主要的原因是椎间盘退变的具体机制仍不明确。既往研究认为椎间盘是不可再生的组织，但越来越多研究表明退变的髓核组织内同样存在可向类髓核细胞分化的髓核间充质干细胞（NP-MSCs）。然而，在椎间盘退变过程中，这些内源性的NP-MSCs并不能向类髓核细胞分化从而起到延缓椎间盘退变的作用，究其原因尚未知。内环境的稳态对于干细胞生物学活性的维持具有重要意义。椎间盘退变后微环境会发生重大改变，呈低pH、低氧、低营养及高渗状态。这些微环境的改变必然会对人NP-MSCs生物学活性产生重要影响，但不同微环境的改变会产生何种影响以及其作用机制如何，均未见报道。因此本课题首先观察了不同微环境（酸环境、氧浓度、渗透压、血清、葡萄糖）对人NP-MSCs生物学活性的影响，然后再深入探讨不同微环境对人NP-MSCs生物学活性影响的作用机制。通过研究发现：1）低pH、低血清、低葡萄糖浓度和高渗均会抑制人NP-MSCs的增殖，增加其凋亡，抑制NP-MSCs相关干性基因（Oct4、Nanog、Jag1和Notch1）的表达，降低II型胶原、蛋白多糖和Sox-9基因的表达，从而抑制人NP-MSCs生物学活性；2）低氧会促进促进人NP-MSCs的增殖，抑制其凋亡，提高NP-MSCs相关干性基因（Oct4、Nanog、Jag1和Notch1）的表达，增加II型胶原、蛋白多糖和Sox-9基因的表达，从而促进人NP-MSCs的生物学活性；3）氧浓度的改变主要通过上调低氧诱导蛋白HIF-1α的表达，并利用糖酵解提供能量从而促进NP-MSCs的生物学活性；4）酸环境的改变主要通过酸离子通道蛋白抑制NP-MSCs的生物学活性。利用阿米洛利阻滞酸离子通道蛋白后，可有效改善低pH对NP-MSCs生物学活性的抑制作用。通过本研究，不仅明确了椎间盘退变过程中不同微环境对人NP-MSCs生物学活性的影响，为椎间盘退变的病因学提供了新的理念；而且发现阿米洛利有望改善酸环境降低对内源性NP-MSCs的抑制作用从而起到延缓椎间盘退变的作用，为椎间盘退变的防治提供了新思路和新靶点。