APC分子调控肠CBC细胞极性及不对称自我更新分裂的作用机制研究

肠隐窝CBC干细胞通过不对称分裂进行自我更新，家族性腺瘤息肉病存在APC分子功能缺失及其CBC细胞异常，但其内在机制不清，本项目提出APC功能缺失是通过影响CBC细胞极性和分裂纺锤体定向使不对称分裂转换为对称分裂而导致CBC细胞异常，即APC分子调控CBC细胞不对称分裂。拟通过（1）研究APC（+/+）、APC（-/+）及APC（-/-）的肠组织CBC细胞紧密连接和极性蛋白复合体Par的表达和共定位；及CBC细胞分裂纺锤体的定向和命运决定子Numb的分布，揭示APC对CBC细胞极性和命运决定子不均等分布的调控作用。（2）分离培养CBC细胞，以APC shRNA抑制APC表达，通过膜标记观察细胞分裂，检测Numb分布，隐窝形成，细胞分化等试验，体外证实APC在CBC细胞不对称自我更新分裂中作用及机制。该研究为调控和维持肠粘膜上皮稳态提供新的理论依据，为肠道粘膜来源的相关疾病的防治提供新思路。

肠黏膜屏障包括:机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障。肠粘膜粘液屏障是上皮细胞表面覆盖的由粘蛋白形成的水化的凝胶样粘液，而肠黏膜上皮屏障是肠上皮本身及其紧密连接构成的在体内外环境之间形成一种组织学屏障，它们都具有机械性的保护作用。Numb分子因其能够不对称的分布到干细胞的两个子代细胞，并能够通过抑制Notch信号通路而使子代细胞具有不同的“命运”而引起人们的广泛关注。既往研究显示Numb表达在包括乳腺，肺，睾丸，唾液腺等在内的大多数组织上，但Numb在肠上皮细胞的表达及其功能目前还没有报道。我们预实验发现Numb并非表达在肠隐窝底干细胞上，而是普遍的表达在沿着隐窝-绒毛轴的所有上皮细胞上。既往研究发现，Numb能够调节细胞的分化，调节细胞粘附，细胞迁移和细胞极性。在肠粘膜上皮细胞上，Numb 是否能够通过抑制Notch通路促进肠上皮细胞粘蛋白Muc2的分泌及肠粘膜屏障的形成，以及Numb能否通过调节肠上皮细胞间顶端连接复合体（Apical junctional complex，AJC）的组装而维持肠粘膜上皮细胞屏障的完整性目前还不清楚。.围绕以上问题，本研究揭示了Numb分子与Notch通路相关分子Hes1，Hath1的表达定位关系。通过干扰Numb分子的表达揭示了其在肠上皮细胞中对Notch通路的抑制作用，及其对肠上皮细胞LS174T细胞杯状细胞表型的影响。利用Caco-2单层细胞模型，揭示了Numb在肠上皮单层细胞屏障形成中的作用，并揭示了其通过抑制肌球蛋白轻链磷酸化及改变细胞微丝骨架的结构影响上皮细胞屏障通透性的作用机制。