细菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli)一个新型致病基因的作用机制研究

Bacterial fruit blotch (BFB), caused by Acidovorax citrulli, is a devastating, quarantine disease of cucurbits. Understanding the molecular and genetic basis of BFB pathogenesis will be helpful to develop effective disease control measures. By creation and screening a transposon tagged A. citrulli mutant library, we obtained a novel pathogenicity gene designated T in previous research. In this application we aim at genetic and molecular characterization of gene T in both A. citrulli and in the distant Pseudomonas syringe pv. tomato, by gene knockout and genetic complementation assays. To further elucidate the mechanism of gene T in pathogenicity of A.citrulli, a bacterial two-hybrid assay will be employed to screen for its interacting protein(s). The identified gene(s) will be functionally analyzed by genetic and molecular approaches. The genetic and molecular dissection of gene T function in A. citrulli and P. syringe will be helpful to an increased understanding of bacterial pathogenesis and to the development of novel disease control measures.

细菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch, BFB）是一种能够种传，可以对葫芦科植物造成毁灭性为害的检疫性病害。本项目申请人以前期通过西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）- - 黄瓜互作的模式病害体系筛选转座子插入突变体，在获得一个新的致病基因T的基础上，拟通过基因功能互补以及同源基因敲除的途径进一步验证基因T的致病功能；利用细菌双杂交系统筛选T蛋白的互作蛋白，并通过基因敲除等途径分析候选互作蛋白的功能，在此基础上解析T基因在病菌致病过程中的作用机制，为建立拥有自主知识产权、新型高效的细菌类植物病害防治新途径、新方法提供科学依据。

细菌性果斑病（Bacterial Fruit Blotch，BFB）是一种对葫芦科植物造成毁灭性危害的种传检疫性病害，其病原菌为西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)。目前，针对BFB的防治措施极其有限，该病害已经成为全球葫芦科作物产业的严重威胁。本研究以前期筛选西瓜食酸菌FC440菌株的Tn5转座子插入突变体库获得的一个致病性缺失突变体为材料，鉴定出突变基因编码产物为苏氨酸醛缩酶（Threonine Aldolase，以下简写为TA），基因功能互补实验、寄主组织内菌群增殖检测以及在西瓜食酸菌AW0601菌株同源基因敲除实验均证实TA为西瓜食酸菌的一个必需致病因子，其缺失导致病菌完全丧失对寄主植物的致病性以及诱导非寄主植物烟草产生过敏性坏死反应的能力，但对病菌的胞外纤维素酶活性和胞外蛋白酶活性影响不大，对胞外多糖分泌、生物膜形成和菌的游动性也不会产生显著影响；模式植物病原菌丁香假单胞菌和野油菜黄单胞菌中同源蛋白缺失的分析暂时未发现TA参与其菌的致病性，表明TA蛋白在不同病原菌中功能的差异性；系统进化分析表明西瓜食酸菌FC440菌株的TA蛋白与模式菌株AAC00-1中的为同源蛋白，并与来源于大肠杆菌中的蛋白亲缘关系非常近；依据酵母双杂交技术原理，本研究通过同源重组的方法构建获得了库容量达2.2×106 CFU/mL、文库重组率为95.8 %、文库插入片段的平均长度在1.5kb左右的西瓜食酸菌侵染下的黄瓜子叶的cDNA文库，该高质量文库为筛选研究西瓜食酸菌与寄主间相互作用的功能蛋白奠定了基础；构建的西瓜食酸菌TA基因的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-TA，在经ADE2、HIS3、LacZ等报告基因活性检测、与空载体pGBKT7在营养缺陷型培养基中生长状况的对比分析，均显示该载体对酵母菌株AH109无自激活能力及毒性作用；利用诱饵载体pGBKT7-TA筛选西瓜食酸菌侵染下的黄瓜子叶cDNA文库，未发现文库中存在与TA互作的蛋白，表明在病菌侵染寄主的过程中，TA仅作用于病菌内部，其互作的因子存在于细菌内部而非植物中。本项目研究首次发现并验证了一个新型的细菌致病因子--苏氨酸醛缩酶，该发现为发掘出防控细菌性果斑病害的新方法、新措施开辟了一个新的领域。