利用天然小肠脱细胞支架再生功能性小肠的实验研究

Small intestinal transplantation is an optimal approach for the treatment of short bowel syndrome (SBS). However, the shortage of donor organs and the risk of immune rejection limit its application. Recently, whole organ regeneration based on perfusion decellularization and recellullarization develops an alternative to donor organ transplantation. In our previous work, we have successfully created a perfusion-decellularized small intestine scaffold (PD-SIS) with intact 3D architecture in rats and Beagle dogs. DNA quantification, histological examination, and electron microscopy show removal of cellular elements with preservation of the native architecture and ultra-structure.It preserves the the major components of extracelluar matrix and biomechanical strength. In addition, the successful application of PD-SIS for the repairment of small intestine defect in a dog model indicates PD-SIS is an optimal scaffold with similar physical and biological characteristics to native small intestine, and could be used for small intestine regeneration. Furthermore, we have successfully isolated and cultured human intestinal stem cell Lgr5 (CD24-/CD44+). Thus, we aim to recellularize PD-SIS with clinically relevant human intestinal stem cells, culture these recellularized constructs under simulated physiological conditions for organ maturation to create a regenerated small intestine which is analogous to native intestine, and evaluate the fesibility of transplanting the regenerated intestine to treat SBS in animal model. The applicant and participants have adequate technical reserves and preliminary test results, which make the research objective achievable.

小肠移植是治疗短肠综合征的理想方式，但目前面临着供体数量不足及免疫排斥两大问题。最近，基于灌注法脱细胞和再细胞的全器官再生技术为器官移植开辟了全新的途径。申请人前期利用灌注法脱细胞技术成功制备了具有完整三维结构和脉管网络的大鼠及犬小肠脱细胞支架并进行了系统评价，证实其脱细胞彻底，保留了天然小肠的组织层次，超微结构以及生物力学特性，富含糖胺聚糖等生物活性成分。申请人还通过动物实验证实小肠脱细胞支架具有再生小肠的可能，是迄今为止最符合天然小肠物理和生物特性的小肠再生支架。此外，申请人还成功分离培养了人小肠干细胞Lgr5 (CD24-/CD44+)。因此，申请人拟通过本课题，探索利用人源性种子细胞对小肠脱细胞支架进行再细胞化，再生出符合天然小肠结构和功能的再生小肠，并利用动物模型验证再生小肠移植治疗短肠综合征的可行性。申请者前期进行了必要的技术储备和预实验，研究目标均能实现。

既往的组织工程小肠不能满足小肠移植和功能替代的需要，其主要不足包括：（1）无法再生自身小肠的细胞形态和表型；（2）缺乏定向排列和组织层次欠清；（3）无吸收和分泌功能；（4）无支配血管，无法实现大范围再生。究其原因，主要是缺乏符合天然小肠组织结构和层次的支架材料以及理想的种子细胞。本研究通过灌注法脱细胞技术制备获得了具有完整三维结构和血管网络的小肠脱细胞支架，并保留了小肠的细胞外基质主要成分，在微观结构上保留了小肠粘膜面的绒毛-隐窝结构，并具有良好的生物相容性。进一步通过建立生物反应器体外培养系统，在小肠脱细胞支架的血管床上植入血管内皮细胞实现了再血管内皮化，并证实再血管内皮化的小肠在体外具有抗血小板凝集的功能。通过在小肠脱细胞支架的肠腔内植入小肠干细胞实现了再上皮化，并通过联合再血管内皮化和再上皮化在体外再生出具备天然小肠基本结构和成分的再生小肠，并最终通过体外和体内移植实验证实了再生小肠具备天然小肠的初步功能，在一定程度上改进了既往组织工程小肠的不足之处，并对组织和器官再生相关研究具有重要的借鉴意义。本课题通过小肠脱细胞方法、再细胞化、体外器官培养和再生小肠移植等多方面进行研究和优化，为在体外再生功能性小肠，使其成为理想的小肠移植和功能替代物奠定基础，此外，本研究再生小肠的相关技术平台也可应用于体外药物评价等其它相关领域。