上转换纳米三色荧光探针制备及其在套细胞淋巴瘤早期诊断及分子靶向治疗中的基础研究

应用肿瘤细胞特异性示踪标记物在活体内成像技术，研究肿瘤发生发展，特别是在早期诊断、治疗中将起重要的作用。因此，我们提出三色上转换纳米粒子-抗体标记/成像的高特异性分子探针及抗CD20靶向药物荧光探针。鉴于前期工作发现核-壳型稀土掺杂纳米粒子上转换发光中，经表面生物功能化后，在极性溶液中分散稳定性和上转换发光强度有较大程度的提高，显示出在分子成像中具有成为分子探针的潜质。本项目拟将①设计、构建MCL特异性抗原CyclinD1、CD5和CD20的单抗三色发光纳米探针，②在体外通过纳米探针与MCL细胞株结合，观察三色纳米荧光探针定性定量特异性标记能力；③在体内建立MCL动物模型，明确纳米荧光探针在动物模型活体组织、细胞内的多色荧光成像效果；提高MCL检测的准确性和灵敏度；④利用抗CD20单抗靶向药物荧光探针，靶向治疗及荧光成像MCL，为MCL的早期诊断、治疗和疗效追踪奠定理论基础和实验依据。

套细胞淋巴瘤（Mantle cell lymphoma，MCL）是一类在病理学、免疫表型和细胞与分子遗传学上具有特征性改变的非霍奇金淋巴瘤，其机制尚未完全清楚，急待探索出MCL早期诊断的有效手段，寻找新的给药途径已成为国际研究热点。我们发现核-壳型稀土掺杂纳米粒子上转换发光中，经表面生物功能化后，在极性溶液中分散稳定性和上转换发光强度有较大程度的提高，显示出在分子成像中具有成为分子探针的潜质。本课题主要研究内容包括：1）二颜色纳米荧光探针的制备；2）EB病毒潜伏感染的静息B细胞模型的建立; 3）MCL细胞株的纳米荧光标记和二色荧光成像研究； 本课题创新点在于发现或揭示了：1) 成功进行了上转换纳米粒子的合成制备及进行表面改性，表明两种上转换纳米粒子在980nm激光的激发下，能够发射出蓝色和绿色荧光，而且其单色性还比较好，表面改性后，其上转换发光也明显提高； 2）建立了EB病毒潜伏感染的静息B细胞模型，本研究建立的CD5+B/EBV细胞具有体内EBV潜伏感染的静息B细胞的特征；3）设计、构建上转换纳米粒子的合成MCL特异性抗原CD5和CD20的单抗二色发光纳米探针，发现Lemieux-von Rudloff试剂直接氧化法修饰上转换纳米粒子，对上转换纳米粒子发光无明显影响。氧化剂将油酸分子氧化成壬二酸，壬二酸末端为羧基（-COOH）基团，羧基修饰的上转换纳米粒子能很好地分散在水中，同时，羧基基团为上转换纳米粒子与抗体的共价偶联奠定了基础； 4）首次在体外通过NaYF4：Yb，Er/Tm上转换纳米粒子纳米探针与MCL细胞株结合，采用不同抗体标记不同颜色发光的纳米荧光探针，对MCL细胞表面的两种特异性抗原进行成像，增强了MCL诊断的特异性。本项目研究为MCL的早期诊断、治疗和疗效追踪奠定理论基础和实验依据。