新型骨-软骨-肌腱三相书页支架对骨腱连接点损伤后梯度结构再生的作用及相关机制研究

Bone tendon junction injury is one of the most common diseases in sports medicine. However, tendon to bone healing is generally recognized as the most difficult hurdle in tendon or ligament reconstructions. The tendon to bone insertion is physiologically characterized with a unique transitional fibrocartilage zone, with calcified collagen fibers connecting to bone and non-calcified collagen fibers connecting to tendon. The applicant has spent over ten years to explore how to enhance tendon to bone healing with an established partial patellectomy model in rabbits. The previous studies showed that the tendon/bone interface was filled with fibrous scar tissue and lack of regeneration of graded tissue organization. In order to provide the best environment for tendon to bone healing, we developed a novel decellularized bone, fibrocartilage and tendon "book" scaffold with multilayers. In the current protocol, we will harvest the bone marrow stromal cells (BMSC) and first culture it separately in osteogenic, chondrogenic and tenogenic stimulation media. Osteoblasts, chondrocyte and fibroblasts will also be harvested. These cells will be used to make cell sheets. These cell sheets were implanted into the three-phased multilayered decellularized "book" scaffold accordingly. This novel scaffolds will be transplanted into the partial patellectomy model, to study the effect of this novel scaffold on tendon to bone healing and the regeneration of graded tendon to bone interface. Furthermore, the related molecular biological mechanism will be explored with in vitro model.

骨腱连接点损伤是最常见的运动损伤之一，如何促进其快速而优质愈合一直是运动医学领域的难题。典型的骨腱连接点由肌腱、纤维软骨、钙化的纤维软骨和骨四层组织构成。申请人长期从事骨腱连接点损伤修复的研究，发现其损伤愈合以紊乱的瘢痕组织为主，缺少梯度结构的再生。为了创造骨腱界面梯度结构的再生条件，在前期研究中课题组率先制备了去细胞的骨-软骨-肌腱三相书页支架。本课题拟在此三相支架上分别复合向骨、软骨和肌腱方向分化的骨髓间充质干细胞片以及骨、软骨和肌腱的原代细胞片，构建细胞片与骨-软骨-肌腱三相书页支架的复合体，再将其植入兔髌骨髌腱损伤模型，以引导体内干细胞迁移、分化、种植和长入此复合体，采用组织学、分子生物学、影像学和生物力学方法综合评估其对骨腱界面的愈合效果，探讨此新型骨-软骨-肌腱三相书页支架对骨腱连接点梯度结构的再生作用。同时，利用体外实验研究其相关的分子生物学机制。为治疗骨腱损伤提供新的思路。

骨腱界面损伤因其高发病率和较差的预后成为了运动医学领域常见的难题。国内外学者研究发现，骨腱界面梯度结构的恢复对其愈合至关重要。而新兴的组织工程技术将成为一项极具前景的治疗选择。.本项目从兔胫骨取骨组织、耻骨联合取软骨组织、跟腱取肌腱组织，制成书页状支架后经脱细胞处理得到各相脱细胞支架。经扫描电子显微镜、组织学染色后可见支架的微观形态结构及胶原、蛋白多糖等细胞外基质成分得以大部分保留。将支架同兔骨髓间充质干细胞共培养，行CCK-8和Calcein-AM/PI死活染色发现三种支架均具有良好的细胞相容性，经扫描电镜检测后发现支架均具有良好的细胞粘附性能，经免疫荧光和qRT-PCR检测发现各相支架具有不同的干细胞诱导分化潜能。之后，我们将兔的骨髓间充质干细胞制成细胞片，置于书页支架的两页之间，再将各支架交叉整合，得到脱细胞三相书页支架-骨髓间充质干细胞片复合体。将此复合体植入兔髌骨-髌腱损伤模型以期治疗骨腱界面损伤，分别在术后8、16周取术侧髌骨-髌腱复合体行影像学、组织学及生物力学检测。影像学检测发现，植入复合体组有较多的新生骨组织生成，在16周时达到了正常的80%左右，骨小梁厚度亦也增加，骨小梁数目略有增大。组织学检测发现新生的骨腱界面有纤维软骨层生成，呈现出从骨至肌腱较为规整的纵行梯度层次分布，在16周时面积最大。生物力学检测发现，植入复合体后拉断载荷在16周后可达到280N左右，接近正常髌骨-髌腱的80%，说明其力学性能恢复良好。.通过本项目的研究，我们认为骨-软骨-肌腱三相脱细胞书页支架联合兔自体骨髓间充质干细胞片能有效治疗兔髌骨-髌腱骨腱界面损伤，其机制可能与不同相组织支架对BMSC定向诱导分化作用有关。此项目的顺利实施，为临床上应用脱细胞支架治疗骨腱界面损伤提供了较为理想的组织工程移植物的选择。.在该项目经费支持下指导出站博士后1名、培养研究生6名，发表SCI论文9篇、CSCD论文2篇，荣获科研奖项4项，申报国家发明专利4项（已授权2项目），参与相关领域国内外重要学术会议10余次。