默诺霉素生成途径中关键蛋白MoeN5催化机理研究及分子改造

In recent years, abuse and misuse of antibiotics have led to the emergence of drug resistance, which warrants the searching for more anti-infectious agents. Moenomycin is an attractive candidate of clinical applications due to its promising efficacy, low toxicity, low drug resistance rate, and few cross resistance with other drugs. However, its further usage is hampered by low water solubility, long half-life in blood, and invalidity of oral administration. These properties have been related to the long chain fatty acid structure of the moenomycin. Here, we propose to solve the crystal structure and complex structure of the enzyme MoeN5 which participates in the synthesis of moenomycin long chain fatty acid to investigate the compound synthesis machinery. Notably, MoeN5 catalyzes a noncanonical isopentenyl diphosphate condensation reaction. Because MoeN5 shares low sequence identity to the prenyltranferase, its three-dimensional structure is unpredictable and of great interests to the related studies. The structure information of MoeN5 shall reveal the residues required for the catalytic activity and chain length determination, and may provide instrumental guidance for molecular engineering to advance the moenomycin performance.

近年来，由于抗生素滥用而产生了许多超级病菌，这使得寻找新的抗生素已经迫在眉睫。默诺霉素具有高效低毒的特点，且很少有动物抗药性以及与其他药物的交叉耐药性，因此具有很好的药物研发前景。但由于其水溶性较差，在血液中的半衰期很长，口服无效等特性阻碍了其开发为新药物。目前已有报道指出这些重要特性与默诺霉素分子中的脂肪链有关。本课题针对该脂肪链，利用X光晶体学的手段，通过解析脂肪链生物合成途径中的关键酶MoeN5及其与底物复合物的结构，揭示MoeN5的反应机理。另一方面，由于MoeN5催化作用和其他已知的异戊烯基转移酶不同，解析MoeN5的结构，将可更加完整的了解各种异戊烯基转移酶的催化机理。另外，基于结构分析，找到酶活性中心关键氨基酸，研究并揭示对脂肪链合成起到关键作用的氨基酸。最终为通过体外生物合成方法改造高效默诺霉素提供理论指导。

默诺霉素是目前唯一直接抑制细菌肽聚糖糖基转移酶的抗生素，抗菌活性为万古霉素的10到1000倍。自1950年代开始在畜牧业使用至今少有抗药性出现，极有可能在将来开发成为人类用药，因此其生物合成途径备受重视。默诺霉素合成步骤中的MoeN5，负责将10个碳的GPP接上15个碳的1-糖基-法尼基磷酸甘油酸酯（FPG）以生成25个碳的产物。由于默诺霉素的碳链长短与抗菌活性相关，故MoeN5催化反应甚为关键。申请人通过结构解析的方法。获得了MoeN5底物复合体的结构数据，解释了其催化反应的分子机理，明确了造成GPP脱去磷酸头形成碳阳离子之后被1-糖基-FPG第6至11号碳之间的电子攻击，从而实现了两分子以“头-碰-中”方式对接，在经过环化重排生成特殊的碳链。另外，成功解析了辅助分析碳侧链长度的FamD1底物复合体的结构，并对关键作用氨基酸进行分析。明确FamD1在去质子化过程中最可能作为质子受体的氨基酸是R60和D277。通过结构分析解释了MoeN5的催化机制，探索了不同长度碳链的反应机理。为用生物合成法改良默诺霉素提供理论基础。另外，在研究过程中获得使用Sso7d作为融合蛋白来改变蛋白晶格堆叠的方法，为今后解决相似为题提供一种参考方法。