抗原介导仿生合成免疫刺激功能性诊疗探针及其抗肿瘤机制研究

In tumor microenvironment, immune cell dysfunction, hypoxia, high GSH levels and other factors greatly limits the anti-tumor efficacy and prognosis. Therefore, it is very important to design and fabricate functional probes with both immune stimulating ability and simultaneously regulating the tumor microenvironment for synergistic treatment. Applicant's preliminary study found that the model antigen OVA has good performance in in-situ biomimetic synthesis of manganese dioxide nanoparticles (MnO2 @ OVA) with immune adjuvant properties and with high antigen loading. Particularly, MnO2 @ OVA can significantly activate CD8+ T cells and secrete IFN-γ. However, it's not yet clear how it works. To this end, the project will focus on the study of its immune stimulation mechanism, and further the use of MnO2 to regulate (deplete or utilize) overexpression factors in tumor microenvironment. With this feature, the project further exerts biomimetic integration of photosensitizer Ce6 into MnO2 @ OVA, providing an immune / PDT dual enhanced MnO2 @ OVACe6 probe with MR/US imaging functions. This project uses antigen to directly synthesize immune stimulating intelligent complex, with high antigen loading and tumor specificity. We will use mouse tumor model to evaluate the lymph node migration ability of DCs in vivo after probe loading, and explore the effect of immune memory response, in-depth study of its immune activation and anti-tumor mechanism. This study will provide experimental evidence for the development of a new type of multi-functional tumor vaccines that are efficient and safe.

肿瘤微环境中免疫细胞功能低下、乏氧、高GSH水平等因素极大限制了抗肿瘤疗效及预后。因此设计和制备具有免疫刺激功能性探针并能同步调控肿瘤微环境进行增效治疗显得尤为重要。申请人前期研究发现：模式抗原OVA可原位仿生合成具有免疫佐剂特性的二氧化锰纳米粒（MnO2@OVA），抗原负载率高，能显著激活CD8+T细胞并分泌IFN-γ，但其作用机制尚不明确。为此，本项目将着重研究MnO2的免疫刺激作用机制，并利用MnO2具备调控（耗竭或利用）肿瘤微环境中过表达因子的特性，拟进一步仿生集成光敏剂，获得具有示踪功能的免疫/PDT双增强MnO2@OVACe6诊疗探针。本项目利用抗原直接仿生合成免疫刺激性智能复合物，具有高抗原载量和肿瘤特异性，利用小鼠肿瘤模型评价探针负载后DC的体内淋巴结迁移能力，探究其免疫记忆应答效应，深入研究其免疫激活和抗肿瘤作用机制，为研制高效安全的新型多功能肿瘤疫苗提供实验依据。

肿瘤疫苗介导的免疫治疗及其联合治疗疗效受到肿瘤微环境中多种因素影响，如肿瘤微环境中免疫细胞功能低下、乏氧、高谷胱甘肽（GSH）水平等。因此，针对肿瘤微环境多因素干预，设计、制备安全、高效的多功能肿瘤疫苗探针，调控肿瘤微环境增效治疗成为肿瘤疫苗开发的重点。本项目研制的肿瘤免疫刺激性探针具有以下特征：免疫刺激性强、抗原负载率高、肿瘤特异、绿色合成、生物安全性好等。首先，我们利用模式抗原鸡卵清蛋白（OVA）原位仿生合成二氧化锰纳米粒（MnO2@OVA），通过二氧化锰来消耗肿瘤微环境中的高浓度GSH和过氧化氢（H2O2），产生氧气，调控肿瘤微环境。数据显示该探针具有尺寸小、水中分散性好的特征，且在GSH或H2O2存在下，其r1弛豫率分别提高6.1和7.5倍，可实现肿瘤组织磁共振信号的特异性增强。进一步地，我们在细胞水平研究了MnO2@OVA功能纳米复合物的免疫刺激功能和相关激活机制。研究结果显示，经过MnO2@OVA纳米颗粒刺激后，CD80+CD86+双阳性BMDC细胞的比例提高1.9倍，CD11c+MHCI+双阳性BMDC细胞比例从4.56%增加到了8.19%，表明MnO2@OVA纳米粒促进BMDC细胞的表面高表达具有抗原递呈能力的分子MHCI，从而促进BMDC细胞深度活化。另外，动物实验数据显示，MnO2@OVA注射1天后可以迁移到腹股沟淋巴结，且在淋巴结部位可稳定存在7天，有效地刺激小鼠体内淋巴结DC细胞表面高表达CD80、CD86共刺激分子，促进小鼠体内DC细胞的活化，并进一步激活CD8 T细胞。并且，MnO2@OVA作为预防性疫苗和治疗性疫苗的抗肿瘤实验结果证实了其作为肿瘤疫苗探针的有效性。此外，本项目开发了免疫刺激性探针用于化疗/光动力增效肿瘤免疫治疗，增强了肿瘤免疫原性，促进了免疫响应，提高了免疫治疗反应率，既能有效消融肿瘤原发灶，又能抑制肿瘤进一步肺转移等相关扩展性研究。在项目实施过程中以通讯作者共发表SCI论文18篇，获得授权专利3项，获得奖励3项，高质量完成了预期目标。