肿瘤转移预警的蛋白质组分离鉴定新技术新方法研究

恶性肿瘤淋巴道转移是导致患者死亡的最主要原因。然而由于其发生机制尚不清楚，已成为长期以来肿瘤诊治面临的难题之一。本项目拟采用拥有自主知识产权的具有高度同源性且转移能力不同的小鼠肝癌腹水瘤高低转移细胞株模型，发展基于M13噬菌体展示scFv文库的新型蛋白质均衡器，实现样品中高丰度蛋白质的去除和低丰度蛋白质的富集；研制蛋白质分子印迹材料，实现目标蛋白质的选择性富集；研制金属氧化物气溶胶材料和发展糖基化位点化学衍生的选择性富集策略，实现对高低转移细胞株中磷酸化和糖基化蛋白质的识别；构建集成化的多维蛋白质液相色谱分离-在线酶解-多肽纳升液相色谱分离-质谱鉴定的平台，实现样品的高通量分析。此外，还将发展基于多维液相色谱分离的蛋白质相对定量分析策略。上述拥有自主知识产权的蛋白质分离和鉴定新技术新方法的建立，对在蛋白质组水平上揭示恶性肿瘤细胞淋巴道的转移机制，实现临床的预警和诊治具有重要意义。

根据项目任务书，本项目开展了蛋白质组样品预处理技术、高通量蛋白质组分离鉴定平台、高灵敏检测技术等方面的研究工作，并将发展的新技术新方法应用于肝癌腹水瘤高低转移细胞株差异蛋白质组学研究。在蛋白质组样品预处理技术方面：发展了基于噬菌体展示单链可变区片段文库为配基和基于两性电解质载体的新型蛋白质均衡器，可将血浆蛋白质的鉴定数量提高1.5倍以上；发展了用于血清白蛋白去除的蛋白质分子印迹聚合物，实现了血浆中高丰度蛋白质的选择性去除；发展了基于三磷酸腺苷二钠为配体的固定化金属离子磁性材料和二氧化钛气凝胶材料用于磷酸化蛋白质/多肽的选择性富集，发展了核壳结构硼亲和纳米颗粒和半胱氨酸功能化纳米金掺杂亲水作用色谱整体柱用于糖基化蛋白质/多肽的选择性富集，富集效率可提高1-2个数量级。在高通量蛋白质组分离鉴定平台方面：发展了1种溶液置换接口，除盐效率可达99%；构建了HILIC-SCX-PNGase F IMER集成化样品预处理装置、反相色谱-溶剂置换接口-固定化酶反应器-反相色谱-质谱以及集成化蛋白质相对定量系统，并成功的应用于小鼠肝癌腹水瘤淋巴道高低转移细胞株差异蛋白质研究。在高灵敏检测技术方面：发展了基于水溶性磺酸-3H-吲哚菁染料—sb-cy3-NHS蛋白质衍生试剂、C8功能化磁性介孔杂化微球富集材料和基于磁性氧化石墨烯的基质的亲水性酶解材料，可将蛋白质的检测灵敏度提高1-2个数量级。最后将新技术新方法进行整合，发展了3种蛋白质组学相对定量方法、1种磷酸蛋白质组学和1种N-糖基化蛋白质组学相对定量方法，并应用于小鼠肝癌腹水瘤淋巴道高低转移细胞株差异蛋白研究，结合传统的2D-DIGE定量方法，发展了共鉴定到559种差异蛋白质，对17个差异蛋白进行生物学验证，发现了6种蛋白质有可能是与肿瘤相关蛋白。发表SCI论文47篇，申请专利5项，培养博士后1名，博士研究生10名。