猪附红细胞体膜蛋白和膜蛋白基因的筛选与鉴定

Eperythrozoonosis is a new zoonosis,which is caused by Eperythrozoon,not only difficult to be paid attention,but also has potential threat.In recent years, certain progress has been achieved on the research of Eperythrozoonosis. However, little research has been attempted about membrane protein of Eperythrozoon. Given the current study situation of Eperythrozoonosis and the importance of membrane protein research, the models of Mycoplasma suis infected rats will be established and membrane protein of Mycoplasma suis will be extracted in this study. Membrane proteins and membrane protein gene of Mycoplasma suis will be screened,identified and analysed by comparative proteomics, immunology proteomics, mass spectrometry and bioinformatics technology.And the comprehensive and system research of membrane proteins and membrane protein gene in Mycoplasma suis will be carried out. In order to lay the foundation for further study of Eperythrozoonosis prevention.

附红细胞体病是由附红细胞体引起的，不易引起重视，但具有潜在威胁的新发人兽共患病。近年来，虽然国内外对附红细胞体病的研究取得了一些进展，但关于附红细胞体膜蛋白方面的研究却鲜有报道。鉴于该病目前的研究现状和膜蛋白研究的重要意义，本研究拟在建立猪附红细胞体感染小鼠动物模型的基础上，提取猪附红细胞体膜蛋白；通过比较蛋白质组学、免疫蛋白质组学、质谱鉴定和生物信息学等技术手段对猪附红细胞体膜蛋白和膜蛋白基因加以筛选、鉴定和分析；进而对猪附红细胞体膜蛋白和膜蛋白基因进行全面系统的研究，以期为附红细胞体病防治的深入研究奠定基础。

为筛选和鉴定猪附红细胞体膜蛋白和膜蛋白基因，项目组圆满完成了3项计划研究内容，并进行了拓展研究。对猪附红细胞体小鼠感染模型进行了建立条件的优化，通过对比，以猪阳性血液感染切脾的昆明种小鼠的方式建立小鼠感染模型效果最优；成功提取的猪附红细胞体水溶性膜蛋白的分子量主要集中在45-180KDa，脂溶性膜蛋白主要集中在25-35KDa；并基于猪附红细胞体膜蛋白成功建立的间接ELISA检测方法，该方法特异、敏感，可用于猪附红细胞体的血清学检测；对猪附红细胞体膜蛋白成功进行了质谱鉴定和数据库检索，成功检索出了7个猪附红细胞体膜蛋白；应用生物信息学技术和基因工程学技术，对质谱鉴定成功的膜蛋白基因进行克隆，首次成功克隆了猪附红细胞体吉林株ENO基因，克隆的基因片段长1200bp，编码393个氨基酸。此外，制备和鉴定了2株抗猪附红细胞体单克隆抗体；应用抗猪附红细胞体单克隆抗体，建立了猪附红细胞体双抗夹心ELISA检测方法，可作为猪附红细胞体的快速检测的方法；获得了猪附红细胞体吉林株2-DE图谱，筛选出9个蛋白点被猪附红细胞体感染血清和单抗所识别；以ENO基因为靶基因，成功建立了猪附红细胞体SYBR Green荧光定量PCR检测方法和PCR-ELISA检测方法，可用于猪附红细胞体病的临床诊断；体外原核表达了猪附红细胞体ENO基因，成功构建了真核表达质粒PVAX1-ENO和Ad5-M/ENO重组腺病毒；重组蛋白和建立的 Prime-boost 免疫策略，可显著提高小鼠的体液免疫水平，并在一定程度上刺激小鼠细胞免疫水平；成功的构建了VP22与EGFP、三种弓形虫抗原的融合表达重组质粒。并将重组质粒pcDNA-VP22-EGFP成功在COS 7细胞中表达。本项目的完成为猪附红细胞体病的诊断和疫苗的研究奠定了基础。