长非编码RNA linc00958通过结合DNMT1调控FAT4表达促进肺鳞癌转移的机制研究

Long noncoding RNAs (lncRNAs) play an important role in the metastasis of lung cancer. However, its role in lung squamous cell carcinoma (LSCC) remains largely unknown. We found that linc00958 was significantly up-regulated in LSCC tissues compared with corresponding non-tumor tissues, and its expression level was significantly correlated with tumor size, lymph node metastasis and TNM stage. Then we demonstrated that linc00958 could promote the LSCC cell migration and invasion. In addition, the result of qPCR analysis indicated that linc00958 knockdown increased the mRNA expression of FAT4. Bioinformatics analysis showed that there was CpG island in the promoter region of FAT4, suggesting that it could be regulated by DNA methylation. Moreover, the results of RNA Binding Protein Immunoprecipitation (RIP) indicated linc00958 could bind with DNA Methyltransferase 1(DNMT1), which is the major enzyme responsible for DNA methylation. Therefore, we suppose that linc00958 could regulate the promoter DNA methylation of FAT4 via DNMT1 and represses FAT4 expression, thus promoting LSCC metastasis. We will test the above hypothesis by RIP, Chromatin immunoprecipitation(ChIP) and other methods. This study will clarify the crucial role of linc00958-DNMT1-FAT4 regulation network in LSCC metastasis and provide a novel therapeutic target in patients with LSCC.

长非编码RNA在肺癌的转移中具有重要作用，但在肺鳞癌中研究较少。本课题组经RNA测序筛选和 qPCR 验证发现linc00958在肺鳞癌组织中高表达，且与肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移密切相关。而检索文献并未见其功能的报道。我们预实验结果显示敲降linc00958后肺鳞癌细胞迁移和侵袭能力减弱，而过表达linc00958可以增强肺鳞癌细胞的迁移和侵袭。进一步研究发现linc00958可以下调抑癌基因FAT4的表达。生物信息学分析显示FAT4启动子区存在CpG岛，提示其可以受DNA甲基化调控。而我们发现linc00958可与DNMT1结合，DNMT1是DNA甲基化过程中发挥重要作用的酶。故我们推测linc00958通过与DNMT1结合，抑制FAT4表达促进肺鳞癌转移。拟通过进一步研究明确linc00958通过FAT4调控肺鳞癌转移的作用及具体机制，为寻找肺鳞癌转移的治疗靶点提供理论依据。

本项目首次研究Linc00958和肺鳞癌的相关性，通过临床标本检测，体外细胞水平层面明确Linc00958在肺鳞癌中的重要作用及相关机制。首先从临床标本检测出发，通过qRT-PCR明确Linc00958在30对肺鳞癌组织及其对应正常肺组织中的表达，结果显示相对于正常肺组织标本，Linc00958表达水平在肺鳞癌组织中显著升高。并且分析了Linc00958表达水平与临床病理资料的相关性发现Linc00958 的表达水平与肿瘤大小，TNM分期及淋巴结转移相关。而利用TCGA数据库进一步发现Linc00958表达越高，预后越差，基于以上临床标本及临床资料的研究结果初步推测Linc00958表达升高是肺鳞癌发生发展的重要因素。进一步的体外实验中显示干扰Linc00958表达后可使抑制肿瘤细胞增殖及诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移。说明Linc00958在肺鳞癌中发挥癌基因的生物学功能。.为进一步探究Linc00958诱导细胞迁移和增殖的相关分子机制，我们用FISH实验分析LINC00958主要位于细胞浆，提示我们从转录后途经去探讨Linc00958的作用机制。进一步RIP实验分析在H226、H1703细胞中，LINC00958可与MSI2H相结合。双分子荧光素酶报告基因报告系统分析显示MSI2H可以与对YAP2的3’UTR互补结合。进一步研究表明，与GAPDH相比较，在H226、H1703细胞中，MSI2H干扰后YAP2的mRNA稳定性确实明显减低，Linc00958通过结合MSI2H增加YAP2的mRNA的稳定性。现有研究表明YAP2是Hippo通路中核心效应因子。在肿瘤中发挥重要作用，但其在肺癌中作用尚不明确。而在我们的实验中发现YAP2干扰后也可使抑制肺鳞癌细胞增殖及诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移。而YAP2表达下调后在H226、H1703细胞中Hippo通路下游蛋白（DIAP1、cyclin E、Myc）的表达明显下降。可见YAP2促进肺鳞癌细胞的迁移和增殖。综上所述，Linc00958通过结合MSI2H增加YAP2的mRNA的稳定性而发挥了促进肺鳞癌细胞的迁移和增殖，发挥癌基因的生物学功能，为肺鳞癌发病机制提供新的理论基础。