黄瓜嫩果白色果皮基因（w）的图位克隆和功能分析

The immature fruit color is an important trait in cucumber (Cucumis sativus L.) breeding. It is very important for quality breeding to study the genetics and molecular mechanism of immature fruit color in cucumber. The immature white fruit skin color is controlled by a simply inherited recessive gene w. According to the practical needs and research status of immature fruit skin color of cucumber, this program will fine mapping the white fruit color gene w of cucumber and map based cloning this gene with two F2 populations, and further analysis its functional through quantitative PCR, multi-locus detection and transgene technology. This work will provides a target gene for cucumber immature fruit color breeding and understanding the molecular mechanisms of the white immature fruit color in cucumber.

嫩果果皮颜色是黄瓜重要的外观商用品质性状。研究控制黄瓜嫩果皮色的分子机制，可以为黄瓜皮色的品质育种乃至分子设计育种有重要意义。针对黄瓜嫩果皮色研究中的问题及生产和消费需要，课题组曾对控制黄瓜嫩果白色果皮的基因（w）进行了初步研究,发现w基因是控制黄瓜嫩果白色果皮的关键基因，由一对隐性等位基因控制,并将w基因定位在距侧翼标记2.0和3.2cM的区间内。本项目以此为基础，利用w基因所构建的2个F2代群体，对黄瓜嫩果白色果皮基因w进行精细定位，用图位克隆方法克隆候选基因；采用实时定量PCR，黄瓜种质资源w位点多样性调查和转基因的互补实验等技术，验证w候选基因的功能。这一研究不仅能为黄瓜嫩果皮色品质育种奠定理论基础，提供可直接利用的目标基因，同时为w基因资源的挖掘、筛选和功能分析提供理论依据及技术支撑。

我国为世界上第一大黄瓜生产国和消费国，2016年的黄瓜产量为6190.0万吨，占世界总产量的85.6%。作为影响黄瓜消费的重要商品品质，皮色的遗传与调控机理一直还不清楚，限制着黄瓜的皮色育种。为探明黄瓜嫩果白色果皮的遗传规律及克隆调控基因，本研究选用三个绿皮材料和两个白皮材料，通过构建BC1、F2等遗传群体，探明黄瓜白色嫩果皮是由一个单核基因w控制，利用图位克隆技术将其定位在三号染色体一个8.2kb的范围内，仅含一个候选基因aprr2。克隆其编码序列发现aprr2是由APRR2的单碱基插入而来，单碱基的插入导致读码框发生移码突变，使得aprr2缺失了101个氨基酸，将aprr2./APRR2在大肠杆菌BL21内进行诱导表达，分别在62 kDa和48 kDa左右的位置获得两个差异表达蛋白，大小约为101个氨基酸残基。利用生物信息学分析发现C端缺失的101个氨基酸是APRR2作为一个转录因子的重要功能结构域，将APRR2与GFP进行融合，转入农杆菌GV3101中在洋葱表皮细胞中进行瞬时表达，发现只能在细胞核内检测到荧光信号，用未带有APRR2的空载体侵染洋葱内表皮细胞后，其荧光信号遍布整个细胞。说明黄瓜APRR2基因可以在洋葱内表皮细胞的细胞核内表达。在拟南芥中，APRR2蛋白与类钙调蛋白CML9相互作用，调节植物的生长与发育，通过构建黄瓜aprr2./APRR2的酵母表达载体，发现蛋白APRR2和CML11有相互作用，aprr2和CML11之间不能相互作用，说明C端的101个氨基酸残基是与CML11作用的重要元件，且APRR2与CML11相互作用后通过后续途径来调控果皮叶绿体中的叶绿素含量，通过观察Q30和Q24果皮细胞中的叶绿体，发现Q24的叶绿体数量和所含叶绿素的含量均明显低于Q30，进一步对两亲本果皮叶绿体的亚显微结构进行观察，发现在Q24的单个果皮细胞中，不但其叶绿体的数目较少，其叶绿体的结构也呈现不规则的形状，基粒排列松散，扭曲，数量较少。因此推测，白色与绿色黄瓜果皮颜色的差异是由于APRR2基因突变后，叶绿体的发育受到不良影响，导致叶绿体数目减少，叶绿体结构不完整，进而导致叶绿素不能正常合成，从而表现白色。本研究的成果不仅为分子标记辅助选择育种提供了可直接利用的分子标记和基因，也为揭示黄瓜皮色形成的分子机理提供了重要的参考和理论依据。