RNA去甲基酶FTO突变调控m6A-RNA甲基化修饰致精子发生障碍机制研究

Spermatogenesis inhibition could lead to male infertility directly, the level of N6-Methyladenosine RNA (m6A-RNA) play a key role in the process of spermatogenesis. A whole exon sequencing was used to test NOA samples in our group, the results demonstrated that a point mutation in N6-Methyladenosine RNA (m6A) Demethylase FTO (chr16: 53860082; ENST0000471389; p.Asp144Asn) might give rise to NOA disease. A human embryonic stem cells line with FTO point mutation (hESCs-FTOG→A) that was established in our lab. Research results showed that FTOG→A increased the level of m6A-RNA, and inhibited hESCs-FTOG→A differentiation into human primordial germ cell at earlier stage. FTOG→A mouse model was obtained from our laboratory, experimental results revealed that FTOG→A inhibited the process of spermatogenesis in vivo study. According to the hES cell line and mouse model with FTOG→A. Our aim is to: 1. Molecular biology and cell biology techniques will be used to assess the mechanism that whether FTOG→A disturb the m6A methylation level in hESCs and inhibit the process of hESCs differentiation into human primordial germ cell. 2. According to the mouse model with FTOG→A, molecular biology and cell biology techniques will be employed to assess the mechanism that whether FTOG→A increased the m6A methylation level in mouse model and inhibit the process of spermatogenesis. Our research purpose is figure out that the mechanism between point mutation of FTO and NOA. Our study will provide theoretical and scientific basis to NOA clinical therapy and pathogenic factors in FTO.

精子发生障碍是男性不育的重要因素，m6A-RNA甲基化在其中发挥重要作用。课题组对无精子症患者样本研究，发现RNA去甲基酶FTO点突变（chr16：53860082；ENST0000471389；p.Asp144Asn）可能引发无精子症。进而构建人胚胎干细胞（hESCs）FTO点突变细胞系，发现FTO点突变可导致m6A-RNA甲基化水平升高，抑制hESCs分化为早期原始生殖细胞。构建FTO点突变小鼠模型，发现点突变鼠精子发生障碍。本课题拟在成功构建细胞和动物模型基础上开展进一步机制研究：①应用FTO点突变hESCs模型，分析FTO点突变对m6A-RNA甲基化水平和hESCs分化至原始生殖细胞阶段的影响及机制。②应用FTO点突变小鼠模型，分析点突变对睾丸m6A-RNA甲基化水平、精子发生过程的影响及机制。本研究阐明FTO在精子发生中的作用及机制，为精子发生障碍发病机理分析和临床诊治奠定基础。

生殖健康是关系到国家民族兴衰的重要指标之一，其中不孕和不育是生殖医学亟待解决的两项主题。男性不育约占不孕不育疾病的50%，研究显示，全球大约7%的男性患有不育症，其中无精子症是引发精子发生障碍导致男性不育因素的重要原因，约占男性不育因素的10%左右。因此，对无精子症疾病发生和发病机理的研究是国内外生殖领域研究的焦点问题。m6A-RNA甲基化水平直接影响着基因表达、剪接、RNA的稳定性、RNA的编辑，甚至调控着mRNA降解程度和寿命，并通过以上方式引发细胞凋亡，减数分裂异常，生物节律改变和影响干细胞多能性的维持。m6A-RNA甲基修饰过程与DNA和组蛋白修饰方式一样包括甲基化及脱甲基作用。同时m6A-RNA甲基化也是一种动态过程，即细胞内同时存在甲基化酶和脱甲基酶来调控该可逆过程。前期研究显示哺乳类mRNA的正向m6A修饰作用是由甲基化转移酶METTL3-METTL14复合物催化完成，而甲基化转移酶WTAP是通过影响复合物的形成从而干扰m6A-RNA的修饰作用；逆向m6A-RNA修饰目前已报道包括两种脱甲基酶：FTO（ALKBH9）和ALKBH5。该研究从RNA去甲基化酶FTO着手，探究是否FTO缺失引发精子发生过程障碍及其相关调控信号通路，及多角度阐述精子发生障碍损伤修复机制与氧化应激和自噬的关联。研究阐明了FTO通过对mRNA稳定性和可变剪切过程影响调控四种组织中的网络作用直接和间接机制，深入发现FTO缺失可引发小鼠生精障碍，精子畸形率上升等表型，具有时间依赖性，并发现FTO作用于睾丸间质细胞并引发睾酮和LH激素水平下降。初步揭示了RNA去甲基化酶FTO对精子发生的影响。深入研究证实FTO缺失可引发性腺发育相关的基因DHH的mRNA稳定性影响，并导致其翻译水平抑制。并发现FTO作用于DHH基因m6A-motif区域相关位点位于3’UTR区域产生作用。