β-防御素1对团头鲂巨噬细胞的趋化效应及其机制探讨

Directed migration of macrophages to infection sites in pathogen invasion plays important role in host defenses and effective induction of immune responses. It is reported that β-defensin (BD) is directly against pathogenic microorganisms and induces chemotactic effects in innate immune responses. But it's not clear that the chemotactic effect and mechanism of BD in fish. This study will focus on chemotactic effect and mechanism of β-defensin 1 on macrophages of Megalobrama amblycephala which is a unique economic freshwater fish in China. Based on the completed transcriptome sequence data of the liver and kidney, using flow cytometry, electron microscopy and immunohistochemical, in vivo and in vitro experiments will be performed to observe the migration, morphological changes and sites in the organizations of macrophage stimulated by BD1 for evaluating the chemotactic effects of recombinant protein BD1 on macrophages of M. amblycephala. In addition, real time PCR and Western blot will be performed to analyze the chemoattractant chemokine and GPCRs signaling pathway regulation. This study will be useful for understanding the potential biological functions of defensins in fish and highlight a new way to prevent and control the infection of microbes in fish via interference the inflammatory responses.

巨噬细胞的定向迁移对宿主防御病原入侵和诱发免疫反应至关重要。近年来研究发现，β-防御素(β-defensin, BD)除了具有直接抗病原微生物活性以外，还可以在天然免疫中发挥趋化作用。然而，BD对鱼类吞噬细胞的趋化效应及其机制还不清楚。本项目拟以我国特有淡水经济鱼类-团头鲂为研究对象，在已完成其肝、肾转录组测序基础上，采用流式细胞技术、电镜及免疫组织化学等技术，观察巨噬细胞经BD1处理后的迁移、形态变化及在组织中的定位，确定BD1对团头鲂巨噬细胞的趋化效应；并通过Real time PCR和Western blot等技术分析BD1对相关趋化因子及受体的表达调控，及GPCRs等信号通路在BD1趋化巨噬细胞中的作用，探讨BD1对团头鲂巨噬细胞的趋化效应及其机制，研究结果不仅可以挖掘鱼类防御素的潜在生物学功能，还可以为团头鲂的免疫防治提供新的策略。

本项目将团头鲂BD1基因分别在酵母表达系统和大肠杆菌表达系统中进行了重组表达、分离纯化及活性鉴定。对重组抗菌肽pPICZαA- BD1基因工程阳性菌株在酵母表达系统进行了高密度发酵培养条件的探讨，获得具有抑菌活性的纯化重组蛋白，为下一步研究团头鲂BD1的生物学功能奠定了良好的基础。另外，本项目建立了团头鲂巨噬细胞分离及纯化方法，通过采用34%、51%Percoll密度梯度分离头肾巨噬细胞，台盼蓝染色结果显示细胞存活率在98%以上，巨噬细胞的纯化度可以达到98%，为下一步研究团头鲂巨噬细胞的功能奠定了良好的基础。为探讨团头鲂BD1对其头肾巨噬细胞趋化作用的功能位点，我们设计从N端和C端分别合成1条氨基酸多肽，通过跨膜迁移实验证实了团头鲂BD1在体外对白细胞和巨噬细胞均具有趋化活性，该趋化作用呈剂量依赖型，而且发现N端的趋化作用要显著强于C端；体内趋化结果也证实BD1对团头鲂腹腔白细胞和巨噬细胞具有明显的趋化作用。另外，团头鲂BD1对炎症因子IL-1β和TNF-α的表达具有明显的调节作用，解析了团头鲂BD1发挥趋化作用的可能分子基础和作用通路。本项目研究结果不仅挖掘了鱼类防御素的潜在生物学功能，还为团头鲂的免疫防治提供新的策略，并为鱼类BD在生产上的应用提供理论依据。