无花果拟盘多毛孢pestheic acid生物合成的分子调控

Secondary metabolite production is generally strictly controlled in filamentous fungi and pathway-specific regulation as the basic layer plays a crucial role in the biosynthesis of secondary metabolites. However, the molecular mechanism underlying the activity regulation of pathway-specific regulators is still unknown. Our previous study showed that a ligand-mediated positive feedback regulation was existed in the pestheic acid biosynthesis of the endophytic fungus Pestalotiopsis fici. This project aims to investigate the functions of ptaR1, ptaR2 and ptaR3 and the regulatory relationship between them, determine the key pathway-specific regulator, and finally reveal the molecular mechanism of ligand-mediated positive feedback regulation of the pestheic acid biosynthesis in P. fici. This project will uncover the molecular mechanism of positive feedback regulation from a new perspective, and provide the important theoretical basis for the development and application of novel bioactive compounds.

丝状真菌次级代谢产物的生物合成通常会受到严格的控制，作为最底层的途径特异性调控在其中发挥了重要的作用。然而，目前对途径特异性调控蛋白自身活性调节的分子机制的了解还相当有限。申请人所在课题组的前期研究发现，植物内生真菌无花果拟盘多毛孢pestheic acid生物合成中存在着配体介导的正反馈调节现象。本项目拟从参与pestheic acid生物合成的三个途径特异性调控基因ptaR1、ptaR2和ptaR3出发，采用遗传学和分子生物学等手段，阐明三个调控基因在pestheic acid生物合成中的功能和三者之间的调控关系，确定参与pestheic acid生物合成的关键途径特异性调控因子，并以配体介导的蛋白活性调节作为切入点，最终揭示pestheic acid生物合成正反馈调节的分子机制。本项目研究拟从一个崭新角度理解正反馈调节的分子机制，并为新型活性化合物的开发和应用奠定重要的理论基础。

无花果拟盘多毛孢（Pestalotiopsis fici）是从茶树枝条分离的一株植物内生真菌。截至到目前为止，已从P. fici 中分离鉴定了70 多种结构新颖的次级代谢产物。推测pestheic acid（PA）是新型活性化合物chloropupukeananin合成的前体。基于chloropupukeananin良好的细胞毒，抗病毒和抗菌活性，其前体生物合成的调控研究具有重要意义。本项目以无花果拟盘多毛孢为研究材料，围绕PA生物合成的分子调控机制展开，主要研究内容包括以下三个方面：1，ptaR1和ptaR2在PA生物合成中的功能以及两者之间的调控关系；2，ptaR1和ptaR2在PA生物合成调控中的分子机制；3，PA参与正反馈调控的分子机制。通过深入系统的研究，我们取得了以下研究结果：首先，ptaR1和ptaR2的敲除完全阻断了PA的合成，突变株中PA生物合成基因簇内大部分基因的转录消失或者明显下降，证明ptaR1和ptaR2均正调控PA的生物合成，且ptaR1正调控ptaR2的表达；其次，体外凝胶阻滞实验和体内染色质免疫共沉淀实验证明PtaR1和PtaR2均通过直接作用于PA生物合成基因簇而实现对PA生物合成的调控，截短探针以及定点突变探针的凝胶阻滞实验进一步确定了PtaR2结合的保守序列为5’-MGAKAVT-3’；5’-RACE实验确定了PA生物合成基因簇内除ptaM外其他基因的转录起始位点。ptaE和ptaL的转录起始位点为G，其他基因的转录起始位点为A，证明PA生物合成基因转录起始位点具有偏好性，转录起始位点和翻译起始位点的距离为11-211 bp；最后，体内、外添加PA及其合成前体物的结果表明：PA及其前体物可以增强PtaR2与PA生物合成基因簇的直接结合，促进PA生物合成基因簇内基因的转录，最终促使PA大量产生，从而形成了信号分子PA通过调节PtaR2的结合活性正反馈调控PA生物合成的完整环路。本项目的研究不仅阐明了PA生物合成的分子调控机制，同时也为高产工程菌株的构建和抗生素产量的提高提供了重要的理论依据。