“PPARγ-SIRT1反馈环路”在激素耐药狼疮肾炎脂代谢中的作用及三七皂苷干预的研究

With the new immunosuppressive drugs constantly emerging, the inflammation activity of lupus nephritis can be effectively under control.But the dyslipidemia brought by the disease lead to early atherosclerosis,which is a risk factor of cardiovascular diseases,threatening the long-time prognosis of the patients.Our preliminary study have confirmed that SIRT1 plays an important role in P-gp mediated steroid resistance,and Panax notoginseng saponins can reverse steroid resistance by downregulating SIRT1 expression.Recent studies have found that SIRT1 and PPARγ could interact with each other by "PPARγ-SIRT1 pathway",and PPARγ is a key mediator of lipid metabolism.Based on above,we assume that by intervening "PPARγ-SIRT1 pathway",we can achieve a double effect that reverse the steroid resistance in LN as well as improve their lipid metabolism.In this program,we plan to establish steroid resistance NZB/WF1 mice model of PPARγ high expression and PPARγ low expression through the transfection of siRNA and lentiviral vector plasmid,to clarify the mechanism of "PPARγ-SIRT1 pathway" in steroid resistant LN dyslipidemia at cellular and integral level,and to further confirm that panax notoginseng saponin could regulate this pathway to achieve the double effect.Hopefuuly,this program would provide us with a novel sight and scientific basis of Activating Blood Circulation TCM improving the clinical efficacy of LN.

随着新型免疫抑制剂涌现，使狼疮肾炎（LN）的炎症活动得到了有效控制，但疾病及长期激素引起的脂代谢紊乱导致血管硬化早发，成为心血管疾病的高危因素，威胁着患者的远期生存。我们前期研究证实SIRT1在P-gp介导的LN激素耐药中发挥重要作用，三七皂苷通过下调SIRT1表达逆转激素耐药。新近研究发现SIRT1和PPARγ之间存在相互作用的反馈环路，而PPARγ是脂代谢的关键靶标。因此，我们设想通过干预这一环路，起到逆转激素耐药和改善脂代谢紊乱的双重效应。本研究拟采用NZB/WF1狼疮鼠，构建siRNA及慢病毒质粒转染形成PPARγ低及高表达为对照，分别从细胞和整体水平阐明“PPARγ-SIRT1反馈环路”在激素耐药LN脂代谢紊乱中的作用，证实三七皂苷能通过调控该环路实现双重效应，为活血化瘀法提高LN整体临床疗效提供新的研究思路和科学依据。

本项目在前期研究基础上，采用NZB/WF1自发狼疮肾炎小鼠，通过构建siRNA及慢病毒质粒转染形成PPARγ低及高表达为对照，分别从细胞水平和动物整体水平阐明“PPARγ-SIRT1反馈环路”在激素耐药LN脂代谢紊乱中的作用，证实三七皂苷（PNS）通过调控该环路实现改善激素耐药和脂代谢紊乱的双重效应。研究取得以下重要结果：1.通过siRNA和慢病毒质粒载体转染下调及上调PPARγ或SIRT1，发现并证实激素耐药LN小鼠脾淋巴细胞存在PPARγ和SIRT1之间相互抑制的负反馈环路，该反馈环路的异常激活是SIRT1介导LN小鼠激素耐药的重要机制之一。2.明确了“PPARγ-SIRT1反馈环路”的存在促进激素耐药LN小鼠脂代谢紊乱。由于激素耐药LN小鼠体内高水平SIRT1反馈性抑制了PPARγ表达，结果发现LN鼠脾淋巴细胞内胆固醇含量明显降低，流出率明显增多；实验动物表现出血脂增高，体内调节脂质代谢的重要物质（如ABCA1、ACAT1及CYP7A1）表达异常，腹主动脉内皮细胞凋亡率（尤其晚期凋亡）异常增高，并存在组织病理损伤。3.体内外研究证实，PNS通过对“PPARγ-SIRT1反馈环路”的调节，发挥改善LN鼠脂代谢紊乱及动脉硬化，同时缓解激素耐药及肾保护的双重作用。体外研究表明PNS干预后激素耐药脾淋巴细胞SIRT1表达下调而PPARγ表达上调，细胞内胆固醇流出率下降，胞内胆固醇含量增多。为阐明PNS的作用位点，设立了PPARγsiRNA+PNS组，高表达的SIRT1仍然受到了显著的抑制，表明SIRT1可能是PNS的主要作用位点。体内研究同样观察到PNS具有下调SIRT1高表达及上调PPARγ作用，实验鼠血脂水平、24小时尿蛋白定量、血肌酐、CRP、腹主动脉内皮细胞凋亡率及VCAM-1表达均有不同程度下降，肾脏和腹主动脉病理损伤得到改善，显示出PNS具有缓解激素耐药、调节脂代谢紊乱、抗炎、预防动脉粥样硬化早发、保护肾脏及血管内皮损伤等的多重效应。本研究从另一个侧面突显了“瘀血”在LN激素耐药中医病机中的地位，拓展了以三七为代表的活血化瘀类中药的作用内涵，对防治LN患者动脉粥样硬化，改善患者远期预后具有积极的临床意义。