GDNF对大菱鲆精原干细胞自我更新的调控及机制研究

Sperm is one of key factors in aquaculture to obtain healthy fertilized eggs and juvenile fish, and getting high quantity and quality sperm has become the long-term objectives of farmer and scientist. Under artificial cultivation, the male turbot frequently exhibited part of infertility, together with low quantity and quality sperm. Recent research has shown that the intensive and sustained production of sperm is based on the precise regulation of spermatogonial stem cells (SSCs) self-renew. This result provides new approaches to explain the phenomenon of fewer sperm in turbot. In this study, we plan to investigate the internal relation between SSCs self-renew and the production of sperm of turbot. Next, through internal/external interference experiment, we will explore the mechanism of SSCs self-renew mediated by GDNF. It will better and deepen our understanding of the characteristics of SSCs self-renew and promote the exploration of the mediating mechanism of SSCs self-renew. It will also provide new approach to solve the farming problem and enrich the basic knowledge on gametogenesis.

水产养殖业中，取得高产、优质精子是生产优良苗种的关键因素。大菱鲆在人工养殖条件下精子产量较低、质量较差，且雄性亲鱼可重复使用率很低，严重制约了鱼苗的培育。以前对大菱鲆精子的研究主要集中于精巢发育和精子活性。哺乳类研究表明，精原干细胞（SSCs）自我更新是维持精子发生的根本来源，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）通过激活PI3K-AKT信号通路开启对SSCs自我更新的调控。我们推测大菱鲆SSCs的自我更新及其调控可能与哺乳类相似或者相同，然而迄今我们对此所知甚少。本项目拟以大菱鲆为研究对象，确立SSCs自我更新与精子产量、质量之间的内在关系，分析GDNF及相关因子的表达和分布，并通过体内/体外干扰实验，阐明GDNF对SSCs自我更新的影响以及调控机制。研究结果将极大提升我们对鱼类SSCs自我更新特性和机制的认知，为解释部分养殖鱼类少精、不育的内在原因提供科学依据。

本项目以大菱鲆为研究对象，依托大菱鲆繁殖周期性腺发育调控，研究了大菱鲆生殖周期中SSCs数量与结构，确定了GDNF及其相关因子分布和表达的变化规律，以期探寻GDNF对SSCs增殖、凋亡和分化等的影响。本项目主要研究成果包括：（1）性腺周期性发育受HPG轴的调控，首次发现雌雄垂体随性腺发育的性别二态性，即由性腺未发育期至成熟期雄性脑垂体的相对体积显著增大，而雌性脑垂体则变化不大。（2） 解析大菱鲆SSCs结构特征与变化规律，组织学与FISH结果显示，SSCs定位于生精上皮与精小囊边缘并被Sertoli细胞包裹，SSCs具有一个大而清晰的核，核仁明显，核周围分布有大量线粒体，细胞直径12-14µm，细胞核直径6-9µm；同时，II期性腺SSCs增殖明显，而后增殖减弱凋亡增强，说明性腺发育过程伴随SSCs增殖与凋亡，共同作用维持SSCs自我更新与生殖细胞数量。（3）获得Gdnf与受体Gfra1及其调控通路上相关分子，发现Gdnf/Gfra1高表达于脑与性腺组织，且随着性腺的发育成熟与AKP/PI3K等呈现相同的表达趋势，证实Gdnf与配体结合激活AKP-PI3K通路参与生殖细胞的增殖过程；获得类胰岛素样生长因子Igf3，并与Igf1、Igf2表达分析发现，Igf3和 Igf1、Igf2均参与大菱鲆繁殖过程。（4）离解8月龄大菱鲆获得丰富的精原细胞，并成功培养7天；通过精巢组织培养液与冷冻大菱鲆精子共孵育发现，精子活力明显提升，且快速前向运动精子比例显著增多，说明精巢组织培养液有助于精子活力提升。通过本研究，基于性腺发育调控，解析了大菱鲆繁殖发育过程中SSCs数量、分布及结构特征变化规律，阐明了GDNF参与生殖细胞尤其是SSCs的增殖调节，证实精巢组织培养液对精子活力的提升作用，为提高大菱鲆配子品质提供理论支持，完善了鱼类性腺发育相关理论知识。