具有新颖二硫键骨架的环α型芋螺毒素类似物的设计与构效学研究

Conotoxins are disulfide-rich peptides extracted from the venom of the marine gastropod belonging to Conus genus. The cVc1.1 that was obtained via cyclization of the N- and C-termini of the α-conotoxin Vc1.1 possesses orally active analgesic effect by targeting the α9α10-nAChR as well as the GABAB receptor. The application of the cVc1.1 as analgesic drug is significantly restricted by its extremely high cost on chemical synthesis, and its low activity on the human α9α10-nAChR. To overcome these disadvantages, novel cVc1.1 analogues are designed and their structure-activity is investigated. In this study computational modeling, solid-phase peptide synthesis, NMR structure study, and electrophysiological experiment are performed to mutate two Cys residues of cVc1.1 for simplifying the structure of cVc1.1, and to investigate the interacting mechanism of the side chains of the introduced residues to sustain the conformation and stability of the peptide. On the basis of obtaining stable and structurally simplified cVc1.1 analogues, the interacting mechanism and structure-activity relationship between cVc1.1 analogues and the human α9α10-nAChR are investigated, and the activity of cVc1.1 analogues to α9α10-nAChR is improved without decreasing its potency to GABAB receptor. The results from this study are crucial for design of novel marine analgesic drugs based on conotoxins.

芋螺毒素是一种富含二硫键的小分子多肽，源于海洋腹足动物芋螺分泌的毒液。C、N末端环化的α型芋螺毒素Vc1.1（cVc1.1）是具有口服镇痛活性的芋螺毒素类似物，作用于α9α10乙酰胆碱受体（nAChR）与GABA（B）受体。cVc1.1虽具有被开发为新型镇痛药物的潜力，但它的成药性也受到化学合成成本高昂与对人α9α10-nAChR抑制活性不够理想所限制。本课题针对这两个缺点，开展新型的cVc1.1类似物的设计与构效学研究。采用计算机设计、固定相多肽合成、NMR结构研究以及电生理学测试等方法，通过变异cVc1.1中一对半胱氨酸来简化它的结构，系统研究新引入的氨基酸残基侧链对维系多肽构象与稳定性的作用机制，研究新设计的类似物跟人α9α10-nAChR的作用机制与构学关系并优化它们的活性，同时保留它们在GABA（B）受体的活性。本课题的开展对基于芋螺毒素的新型海洋镇痛药物的研发具有重要意义。

摘要.芋螺毒素是一种富含二硫键的小分子多肽，源于海洋腹足动物芋螺分泌的毒液。C、N末端环化的α型芋螺毒素Vc1.1（cVc1.1）是具有口服镇痛活性的芋螺毒素类似物，作用于α9α10乙酰胆碱受体（nAChR）与GABA（B）受体。cVc1.1虽具有被开发为新型镇痛药物的潜力，但它的成药性也受到化学合成成本高昂与对人α9α10-nAChR抑制活性不够理想所限制。本课题针对这两个缺点，开展了针对Vc1.1作用机制的研究，并以作用机制为指导开展了新型cVc1.1类似物的设计、合成与构效学研究。.首先，采用计算机模拟与定点突变策略获得Vc1.1针对α9（+）α9（-）高活性位点的复合物模型，发现α9亚单位上的N154直接跟Vc1.1上D11形成分子间氢键，该氢键对Vc1.能的贡献为1.9kal/mol，解释了Vc1.1对α9（+）α9（-）位点的选择性。Vc1.1作用机制的明确，为后续芋螺毒素类似物的设计与活性研究指明了方向。.其次，在深化理解野生型芋螺毒素Vc1.1作用机制的基础上，采用计算设计、固定相多肽合成、NMR结构研究以及电生理学测试等方法，研究了含有单一二硫键α芋螺毒素跟乙酰胆碱受体不同亚型的作用机制，阐明了删除一个二硫键对芋螺毒素本身构象、受体结合口袋构象的影响，进一步揭示了2/8位二硫键的删除对芋螺毒素活性的影响机制。.针对芋螺毒素Vc1.1单二硫键类似物2号位开展了筛选工作，设计合成了20多个2号位变异体类似物。结果显示Vc1.1[C2S,C8F]具有比Vc1.1[C2H,C8F]更好的活性。说明2号位引入Ser更有利于多肽活性。基于该结果，设计合成了环化cVc1.1[C2S,C8F]，cRgIA[C2S,C8F]以及cPeIA[C2S,C8F]，并开展了相关活性与结构研究。然而，核磁研究却发现2号位引入Ser对于多肽三维结构的影响却不利，并因此引起了活性的大幅度降低。因此，2/8位引入His/Phe对于多肽三维结构的维系作用应来自两者的协同作用，因此变异His2为Ser2将会导致多肽三维结构较大幅度变化。.总之，天然芋螺毒素成药性存在多个瓶颈，采用计算模拟结合化学修饰是克服这些成药瓶颈有效手段。本课题的研究成果对基于芋螺毒素的新型海洋镇痛药物的研发具有重要启示意义。