适用于鲤的“自杀性”DNA疫苗载体清除机制、清除效果及免疫研究

Conventional eukaryotic expression vector used to construct DNA vaccine caused a common problem: the persistence of DNA vaccine vector in the host after vaccination caused dangerous of autoimmune, immune tolerance and potential integration of DNA vaccine into the host genome. The suicidal DNA vaccine based on an alphavirus replicon can be cleared by apoptosis, but its capacity was small and the process of apoptosis was not under control. In previous research, the metallothionein gene promoter and rearrangement of Caspase-8 gene were inserted into a eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1 and an inducible suicidal DNA vaccine vector was constructed. Based on the above research, the following studies will be carried out: firstly, Annexin V, Tunnel, JC-1 staining are used to detect the apoptosis induced by the suicidal DNA vaccine vector and reveal the degradation mechanism of suicidal DNA vaccine vector. Secondly, by TaqMan PCR, animal vivo imaging technology the degradation efficiency of suicidal DNA vaccine vector will be evaluated. Thirdly, the ORF59 gene will be cloned into the suicidal DNA vaccine vector, then after immunization of carp the antibody titer will be measured to indicate the effects of immunization. The above studies could provide a theoretical basis for the application of suicidal DNA vaccine vector in the development of carp associated DNA vaccine.

用于构建DNA疫苗的常规真核表达载体在机体内可长期存在并持续表达外源基因，增加了宿主免疫及生物安全风险。而以甲病毒复制子为基础的“自杀性”DNA疫苗载体可以自我清除，但其载体容量小，且清除进程无法控制。针对上述问题，本研究将“鲤的金属硫蛋白酶基因启动子和重构型Caspase-8”组成的凋亡元件插入pEGFP-N1载体，构建了一种适用于鲤的“自杀性”DNA疫苗载体。在此基础上，本项目拟开展以下研究：（1）通过Annexin V、Tunnel、JC-1染色等方法检测载体的体外凋亡诱导情况，阐明载体的清除机制；（2）通过TaqMan PCR、动物活体成像等技术，评价载体在鲤体内的诱导清除效果；（3）将鲤科疱疹病毒3型的囊膜蛋白编码基因ORF59插入“自杀性”载体，通过ELISA检测特异性抗体水平，评价载体诱导的免疫效果。通过本项目实施可以为“自杀性”载体应用于鲤的DNA疫苗研究提供理论依据。

本研究构建了适用于鲤的“自杀性”DNA疫苗载体：pEGFP-N1-MTCAS8。通过体内外试验证实了载体的清除效率与机制，并验证了该载体在鲤疱疹病毒3型（CyHV-3）DNA疫苗制备中的适用性。. 体内试验表明，Zn2+诱导后pEGFP-N1-MTCAS8可以从锦鲤体内清除。体外试验中，Annexin V凋亡检测显示，Zn2+诱导后pEGFP-N1-MTCAS8转染细胞的凋亡率提高了1.25～1.83倍（P<0.05），Caspase-8酶活上升66%（P<0.05）。上述研究初步揭示了“自杀性”DNA疫苗诱导了Caspase-8活性升高促进细胞凋亡从而清除了疫苗DNA。. 本研究进一步开展了“自杀性”DNA疫苗载体在防治CyHV-3中的应用研究。首先，从CyHV-3-HZ419的14个囊膜蛋白中筛选了DNA疫苗的候选分子，进一步将ORF59、ORF132以及ORF131完整编码序列分别插入pEGFP-N1-MTCAS8，构建“自杀性”DNA疫苗。第二，重组表达了pORF59、pORF131、pORF132，制备了针对pORF59、pORF132的单克隆抗体，并建立了CyHV-3间接免疫荧光（IFA）检测方法。第三，采用rProteinG亲和层析纯化锦鲤血清IgM，制备了鼠抗锦鲤多克隆抗体。在此基础上，以重组CyHV-3 pORF59、pORF131、pORF132作为包被抗原，以鼠抗鲤多克隆抗体作为检测抗体，结合商品化HRP标记羊抗小鼠IgG，建立了检测上述DNA疫苗免疫后的鲤血清特异性抗体ELISA方法，证明了pEGFP-N1-MTCAS8在鲤DNA疫苗构建中的适用性。. 本研究分离到2株CyHV-3，建立了一种基于MarkersⅠ/Ⅱ位点的nested-PCR分型方法，借助该方法对广东、河南等地CyHV-3进行了毒株分型分析，结果表明，广东地区流行毒株的基因型主要为Ⅰ++Ⅱ－。本研究对CyHV-3基因组进行密码子使用偏好性分析，证实突变压力是CyHV-3基因组密码子偏性的决定因素，并且鲫在CyHV-3的密码子使用模式以及CyHV-3病毒的进化中发挥了重要的作用。上述研究为深入了解病毒的遗传背景、起源、进化以及免疫诊断、防治方法建立提供依据。