眼蠕形螨感染动物模型的建立及其致病机制的研究

Our previous studies showed Demodex mites infestation, including D. folliculorum and D. brevis, is an under-estimated potential cause of ocular surface inflammation.The underlying pathogenic mechanism remains unclear. No animal model is available. Our preliminary studies also suggested that D. brevis is more pathogenic than D. folliculorum. Our pilot studies showed subconjunctival injection of D. brevis homogenate induced ocular surface inflammation. Macrophage and T cells subtype unbalance might play a role. Herein, we plan to establish demodicosis animal model by infesting D. brevis to mouse and evaluate the model by examination of ocular surface inflammation, pathology changes, and the detection of anti-demodex antibodies. We would further compare the pathogenicity of D. brevis and D. folliculorum. For the group model animal with higher pathogenicity, we will investigate the conjunctival macrophage cells, local lymph node Th17/Treg cells, and evaluate the expression of inflammatory cytokines. Further in vitro investigation will target at how demodex infestation stimulates the macrophage and then regulate the Th17/Treg cells imbalance via TLR2 signaling. In summary, we plan to set up demodicosis animal model and further investigate the core pathogenic role, clarify the immune response after infestation, and finally help to identify the therapeutic target of demodicosis and to better understand the systemic demodicosis.

我们新近研究显示蠕形螨感染是眼表炎症以往被忽略但却关键的因素。蠕形螨包括毛囊螨和皮脂螨，致病机制不清，缺乏疾病动物模型是研究的瓶颈。我们前期研究发现小鼠结膜下注射蠕形螨匀浆可诱发眼表炎症、巨噬细胞浸润和IL-6、17等表达升高；皮脂螨致病性可能大于毛囊螨。本研究拟通过点眼和局部注射皮脂螨匀浆建立小鼠眼蠕形螨感染免疫模型，观察眼表炎症和病理改变、检测蠕形螨特异抗体，筛选最佳造模条件并评价模型稳定性和复现性。在最佳条件下比较皮脂螨和毛囊螨的致病力。观察模型动物结膜巨噬细胞数量、淋巴结和外周血Th17/Treg比例和炎症因子变化。体外实验探索蠕形螨是否通过TLR2相关信号通路激活巨噬细胞进而调控Th17/Treg平衡，并研究其分子机制；靶向调控上述机制以验证其在模型中的作用。本研究将首次为蠕形螨致病性提供直接证据、阐明关键致病因素并提供新的治疗靶点，创造药物评价平台，为全身蠕形螨病研究提供依据。

前期研究发现，眼蠕形螨感染与眼表炎症高度相关，蠕形螨在眼表炎症中的作用越来越受到关注，但其致病机制不清楚，蠕形螨是通过直接还是间接途径破坏眼表组织一直存在质疑和争议。由于人是蠕形螨的唯一宿主，传统动物模型难以建立，而免疫动物模型和细胞模型是机制研究必须尝试的方向。本研究制备了不同浓度的蠕形螨匀浆，并将匀浆对小鼠进行点眼、结膜下注射及基质内注射，在细胞和炎症因子水平观察小鼠眼表炎症反应；利用Transwell构建蠕形螨与人眼表上皮细胞的体外共培养体系，观察蠕形螨接触对眼表上皮细胞的影响；开展宏基因组高通量测序和高效液相色谱-质谱技术以分析蠕形螨感染眼表差异性菌群及睑酯差异脂质。我们发现，蠕形螨匀浆干预方式诱发的小鼠眼表炎症反应和体外共培养模型中蠕形螨对人角膜上皮细胞(HCEs)和睑板腺上皮细胞(HMHECs)增殖、炎症和功能表型的影响不具有统计学意义，以上实验说明蠕形螨在眼表缺乏直接致病性，可能通过间接致病。宏基因组高通量测序结果显示，蠕形螨感染眼表微生物组构成失衡，尤其是多种真菌的定植异常增加，差异性真菌的抗原体外显著抑制人HCEs和HMGECs的生长，这说明蠕形螨可能通过携带的真菌定植及相关的免疫反应而间接致病。进一步高效液相色谱-质谱技术显示，蠕形螨感染者睑板腺脂质比例失调，其中脂肪酰类显著减少，而甘油磷脂类、长链脂肪酸及不饱和脂肪酸显著增加，异常堆积的脂质可能参与眼表炎症的发生。本研究为回答蠕形螨直接还是间接致病的焦点问题提供了客观依据，创新性地提出了真菌的异常增加可能为眼蠕形螨相关眼表疾病的核心环节，这是蠕形螨感染致病机制新观点。本研究还通过流调和横断面研究证实皮脂螨更倾向于感染低龄者，并与眼表疾病更相关，致病性较毛囊螨强。相关研究结果发表论文10篇；应邀在多个国际学术会议发言；培养研究生6名。