基于Ni2+介导脲酶活性研究广藿香醇特异性抗幽门螺杆菌的作用机制

Helicobacter pylori is currently a subject of active scientific research on digestive disease due to its high prevalence around the globe. Urease plays a vital role in the pathogenesis of H. pylori. Researches established that nickel ion (Ni2+) and urease accessory proteins were essential for the activation of urease. Blockage of binding between Ni2+ and urease subunits in its active site resulted in massive inhibition of urease. In our previous investigation on Lingnan genuine medicinal herb Pogostemon cablin (Blanco) Benth., its principal ingredient- - patchouli alcohol was demonstrated to exhibit highly selective antibacterial activity against H. pylori and its urease, without affecting intestinal bacterial flora. In a pioneering effort to illuminate possible target and mechanism of its high specificity for H. pylori, the present research was therefore undertaken to investigate its effect on Ni2+-mediated urease activity, via transcription of regulatory gene, expression of corresponding protein of urease, and the interacting mode between Ni2+ and urease subunits in wide type H. pylori strain and its mutants. The present scheme should contribute to possible identification of brand-new anti-H. pylori lead compound and provide promising information for srcreening research of novel urease inhibitor.

幽门螺杆菌（H. pylori）感染发生率高，是目前世界消化病学研究的热点。研究表明，脲酶是H. pylori重要的致病因子，而Ni2+及相关辅助蛋白对脲酶活性极其重要，阻断脲酶活性位点上的Ni2+与脲酶亚单位的结合能有效抑制脲酶活性。课题组在对南药广藿香的研究中发现，其主要成分广藿香醇能高选择性抑制H. pylori及其脲酶活性而不影响肠道正常菌群的生长。因此，本项目拟通过H. pylori基因缺失突变菌的构建，研究广藿香醇对H. pylori脲酶活性、基因转录与蛋白表达调控、以及Ni2+与脲酶亚单位作用模式的影响，阐明广藿香醇特异性抗H. pylori的作用靶点及机制，为新型抗H. pylori先导化合物的发现和脲酶抑制剂的筛选研究提供理论支持。

项目背景.幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是一种选择性定植于胃上皮细胞的革兰氏阴性菌。这种微生物可以在体内定植几十年，越来越多的研究表明H.pylori在胃黏膜层中可以接受和传递信号，调节宿主与细菌之间的动态平衡。若长期感染H.pylori，会显著增加患者发生萎缩性胃炎，肠化生，胃癌的风险。..研究内容.1..广藿香醇对脲酶和洋刀豆脲酶活性抑制作用研究，以H.pylori脲酶和洋.刀豆脲酶为研究载体，通过脲酶活性抑制试验、抑制类型分析、动力学研究、抑制位点分析、分子对接研究，探讨广藿香醇特异性抗及其脲酶的机理。.2..探讨广藿香醇抗幽门螺杆菌（H.pylori）的最小抑菌浓度、杀菌能力以.及影响细菌运动、粘附、超微结构和相关基因表达的作用。.3..通过研究广藿香醇对H.pylori酸抵抗能力的影响及其机制，探讨药物清除体.内H.pylori作用靶点。.4..通过H.pylori脲酶体外诱导细胞损伤模型的建立，模拟H.pylori侵染胃黏膜.特征，考察广藿香醇对脲酶致损伤的影响及其机制。..研究结果.1..广藿香醇抑制H.pylori脲酶和洋刀豆脲酶的半数抑制浓度分别为.2.677±0.789mM 和2.993±0.411 mM，并属于非竞争性抑制类型和反竞争性抑制且呈现浓度依赖性；对脲酶的作用位点可能是巯基，抑制作用具有不可逆性。作用位点可能在脲酶活性中心。.2..广藿香醇抗幽门螺杆菌最小抑菌浓度（MIC）分别为25 μg/ml；表现出较强.的杀菌作用；可以有效的抑制H.pylori的粘附作用和运动能力。 .3. 广藿香醇在20 mg•L-1范围内对H.pylori生存率无影响；而在强酸性（pH=1.0）条件下，广藿香醇表现出明显的杀菌效果；进一步研究中发现广藿香醇在中性和酸性（pH=5.3）条件下对H.pylori体内的尿素酶活性具有明显的抑制作用，同时对于尿素酶的相关基因的表达均有不同程度下调作用；但对UreG蛋白传递Ni2+的过程无明显影响。.4. 广藿香醇可以提升H.pylori感染GES-1细胞的生存率，并抑制其凋亡；降低细胞表达促炎因子，提升抗氧化酶活性，恢复细胞MMP水平有关。..结论.广藿香醇具良好的抑制H.pylori体内外脲酶的作用，并有强大的抑制和杀灭H.pylori的能力，抑制H.pylori运动、