内生真菌GG22促进地黄次生代谢生物合成的生理及分子机制研究

Fusarium oxysporum GG22 strain, which can promote the accumulation of secondary metabolites in Rehmannia glutinosa, were used as experimental materials to the mechanism of the endophytic fungi promoting active secondary metabolites biosynthetic in R. glutinosa.To make sure the critical period of infection by GG22, The GFP transformant of GG22 were used to observe the pattern of infection, colonization and distribution.The physiology and biochemistry responses including plant endogenous hormone, composition changing of signaling molecules, chlorophyll photosynthetic and fluorescence parameters are analyzed, when R. glutinosa seeding were infected by GG22. Transcriptomics were applied to study the influences of R. glutinosa infected by GG22 on the transcriptional level analyze the changes in gene expression profiles, find out the key enzyme which response GG22 infection and accumulation of secondary metabolites in R.glutinosa.It is hopeful to elucidate the molecular mechanisms of the endophytic fungus influence on accumulation of secondary metabolites and provide experimental evidences and scientific basis for revealing the mechanisms of endophytic fungi influence on the quality of traditional Chinese medicine.This is useful exploration for the elucidation of the formation of medicinal material quality and goeherbalism.

本项目以前期发现的能促进地黄次生代谢产物积累的内生真菌尖孢镰刀菌GG22菌株为材料，开展内生真菌促进地黄有效成分生物合成的机理研究。通过构建地黄内生真菌GG22的GFP转化子观察地黄内生真菌的侵染、定殖、分布规律，从而确定GG22侵染的关键时期;分析地黄组培苗在GG22侵染过程中植物內源激素、小分子信号物质的组成变化、叶绿素光合及荧光参数等生理生化应答反应；通过转录组学的技术手段分析GG22对地黄组培苗转录水平的影响，查找基因表达谱的变化，寻找地黄响应GG22侵染、促进次生代谢产物积累的关键酶。通过整合结构植物学、植物学和转录组学等技术手段阐明地黄内生真菌影响地黄次生代谢积累的分子机制，为揭示内生真菌影响中药材品质及其机制提供实验基础和科学依据，从而为从内生真菌的角度阐释药材品质及其地道性的形成进行有益的探索与实践。

中药地黄为玄参科植物地黄的块根，为中国常用的大宗药材。前期课题组从地黄中分离得到一株内生尖孢镰刀菌GG22，初步实验发现其能与地黄组培苗共生。我们以GG22菌株为材料 ，开展了其促进地黄有效成分生物合成的机理研究。结果如下：①GG22能促进地黄组培苗的生长，并显著增加梓醇、毛蕊花糖苷和总环烯醚萜苷类的含量。②GG22定殖过程中，可引起地黄活性氧爆发，进而诱导了体内抗氧化酶活性，保持了ROS的平衡和一定浓度的H2O2。NO、H2O2等信号物质通过协同作用，激活或放大信号，从而可能使地黄次生代谢产物含量增加。③转录组学分析发现，定殖初期、中期及后期的各组之间分别有1790条、939条、2118条差异Unigene。对差异基因进行筛选，发现与环烯醚萜苷合成、毛蕊花糖苷合成、地黄防御反应、内源性激素合成及信号传导等的代谢通路相关基因均有不同程度的变化。综合分析发现，内生真菌GG22的定殖触及地黄病原相模式免疫反应(PTI)和效应蛋白诱导的免疫反应(ETI)，随后引起钙离子异常响应、与抗性相关基因激活。JA、ETh等内源激素信号通路将胁迫信号放大并传递到转录因子从而直接或间接介导激活部分地黄次生代谢产物生物合成酶的活性，从而引起地黄次生代谢产物的积累。④通过高通量测序技术获得了内生真菌GG22共17202个功能基因。比较基因组分析发现，PHI:1051、PHI:2393、PHI:2401、PHI:4194及PHI:1527可能与内生真菌GG22致病性有关。内生真菌GG22快速进化基因中EVM0004286.1、EVM0005842.1、EVM0012499.1可能与GG22体内代谢及可与宿主地黄共生且不致死有关。⑤克隆获得了地黄DXR、GGPPS1、GGPP2、UGT、OPR和AOS等基因，明确了他们在不同组织器官、内生真菌侵染前后等表达模式。基于以上结果，我们初步阐明了地黄内生真菌GG22影响地黄次生代谢积累的分子机制，为揭示内生真菌影响中药材品质及其机制提供实验基础和科学依据。