6种海洋无脊椎动物铁蛋白与重金属相互作用的机制解析与表征

The presence of an invertebrate living in an environment with high concentrations of heavy metals may be associated with the presence of heavy metals in the body. In order to determine the mechanism and long-term ability to tolerate these beaches and marine life enrichment of heavy metals, we intends to use the in vitro soluble expression of protein to prepared bioactive ferritin. Characteristics of qualitative and quantitative characterization heavy metal enrichment was detected, using electron microscopy, circular dichroism, inductively coupled plasma mass spectrometry; Interaction mechanism research of protein and metal were detected by isothermal titration calorimetry. Finally through crystal structure analysis, to determine the relationship between the structure and function of ferritin and infer regulatory pathways and networks characterization of biological and environmental adaptability, find the solution mechanism of heavy metal toxicity of iron protein To lay the foundation for further research on the management of heavy metal pollution in marine environment in the future.

为了确定这些生活在滩涂和海底的生物对有毒重金属的长期耐受的能力、富集重金属的机理，课题组选择2种海洋蠕虫类、2种滩涂贝类和2种底栖棘皮动物，拟构建体外可溶性蛋白表达系统，制备6种有生物活性的重组铁蛋白（ferritin）；利用电子显微镜、圆二色光谱、电感耦合等离子质谱（Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS），定性和定量表征铁蛋白富集重金属作用后的各种特性；通过等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）研究铁蛋白和金属、金属间的相互作用机制。研究 6种无脊椎动物分类地位、生活环境、铁蛋白的结构及富集重金属能力的差异；最后透过晶体结构解析，确定重金属和铁蛋白相结合的氨基酸，铁蛋白的结构和富集重金属的关系，寻找铁蛋白的解重金属毒性的机理，为今后的进一步研究海洋环境重金属污染的治理奠定

治理环境重金属污染，寻找快速灵敏的检测方法和去除技术已经成为了世界范围的难题，从事这方面的研究意义重大，而铁蛋白是最好的纳米材料。鉴于此，本项目构建了6种海洋经济无脊椎动物7种铁蛋白的pET28a-His- SUMO-Fertin表达质粒和大肠杆菌BL21（DE3）可溶性表达载体。通过IPTG低温诱导、亲和层析纯化，获得了7种高纯度铁蛋白。X-ray衍射技术分析发现：该蛋白以432对称方式穿过蛋白球外壳中心，形成6个四项轴通道、8个三项轴通道和12个二项轴通道。亚铁氧化活性中心包裹在4个α 螺旋的中心区域，在金属的氧化活动中起着重要作用。不同物种的氧化活性中心氨基酸残基略有差异。铁蛋白的球形外壳上有8个保守的亲水性氨基酸组成的三相对称轴通道，因其具有亲水性和强电负性，被认为是金属离子进出铁蛋白的重要通道。纽虫铁蛋白三相通道结合了两个铁离子，其中靠近通道口外侧的铁离子与四个水分子形成水合铁离子；靠近三相通道口内侧的铁离子与Glu130上的O原子形成键长为2.2Å的Fe-O键。两个铁离子之形成4Å的Fe-Fe桥键。四相通道是非保守的金属离子通道，在不同的物种中其亲水性和疏水性有所差异。四相通道口处电势呈现正电性，不利于金属离子进出，该位点未结合金属离子。等温滴定量法研究发现铁蛋白和金属离子可相互作用，结合顺序为Pb> Hg> As> Cr> Cd> Mn。ICP-MS检测发现泥蚶铁蛋白可平均富集2541个Fe2+，144个Cu2+。1个仿刺参重组铁蛋白能富集126个Mn2+，168个As2+，241个Cd2+，400个Hg2+，1417个Cr3+和4000个Pb2+，定点突变确定金属离子进入铁蛋白大部分是三相通道，而不是四相通道。CD研究证明蛋白笼在一定的pH条件下可以聚合解聚条件，所以，铁蛋白是目前最好的富集和检测重金属的纳米材料。