粪肥施用菜田系统中抗生素抗性基因的增殖与迁移机制研究

The application of manure is one of the main reasons for enrichment and spread of antibiotic resistance genes (ARGs) in natural environment. Many studies have shown that the application of manure increases the diversity and abundance of ARGs in farmland ecosystems. However, the mechanism on the origin and migration of the proliferating ARGs in farmland ecosystem is still not very clear. In this study, the vegetable field system with manure application was chosen to analyze the common, unique and dominant ARGs among manure, soil and vegetable by using metagenomic sequencing and droplet digital PCR (ddPCR). The correlation and variation partitioning analysis will be used to study the effect of organic matter, antibiotics, heavy metals, microbial composition and mobile genetic elements (MGEs) on antibiotic resistance genes. The study will elucidate the main sources of proliferating ARGs in soil and vegetables, reveal which ARGs migrate from manures to soil and vegetables, and confirm if the proliferation of indigenous ARGs in soil is due to manure application. The results will give more insights into the transmission mechanism of ARGs in vegetable fields and also are helpful to assess ecological risks of ARGs and formulate reasonable control measures.

畜禽粪肥的施用已成为环境中抗生素抗性基因（ARGs）富集传播的主要原因之一，给生态环境及人类健康带来严重威胁。大量研究表明，畜禽粪肥的施用能引起农田生态系统中ARGs种类和丰度增加，然而对于这些增殖的ARGs的源解析及其在农田生态系统的迁移规律还缺少系统研究。因此，本项目以施用粪肥的菜田系统为研究对象，采用宏基因组测序与微滴数字PCR技术，解析粪肥、土壤以及蔬菜中共有、特异性以及优势ARGs的组成和丰度，阐明土壤与蔬菜中增殖的ARGs主要来源，揭示粪肥中哪些ARGs容易迁移到土壤与蔬菜中，以及土壤中土著性ARGs因粪肥施用的增殖规律；利用相关性及变量分割分析等生物信息学方法，研究土壤有机质、抗生素、重金属、微生物组成、可移动元件（MGEs）等理化生物因素与ARGs的相关性。本项目成果将为揭示菜田系统中ARGs的传播机制、评估其生态健康风险并制定合理的控制措施奠定理论基础。

畜禽粪肥的施用已成为环境中抗生素抗性基因(ARGs)富集传播的主要原因之一，给生态环境及人类健康带来严重威胁。大量研究表明，畜禽粪肥的施用能引起农田生态系统中ARGs种类和丰度增加，然而对于这些增殖的ARGs的源解析及其在农田生态系统的迁移规律还缺少系统研究。因此，本项目以施用粪肥的菜田系统为研究对象，采用宏基因组测序与微滴数字PCR技术深入对比分析了不同类型粪肥及其施用对土壤、蔬菜中微生物组与抗性组的作用，研究发现鸡粪肥中抗生素的残留量高于羊粪与牛粪，灭菌处理可显著降低粪肥中抗生素残留。不同粪肥对土壤中ARGs增殖的贡献率不同，施用牛粪肥土壤ARGs增殖率高于施用鸡粪肥与羊粪肥的土壤；施用鸡粪与羊粪土壤中土著抗生素抗性菌对ARGs增殖的贡献率高于外源粪肥中抗生素抗性菌的贡献率；施用牛粪土壤外源粪肥中抗生素抗性菌的贡献率高于土著抗性菌。不同粪肥对微生物群落组成的影响不同，施加鸡粪会增加土壤中Promicromonospora和Lysobacter的相对丰度， 施加羊粪可增加土壤中Saccharothrix和Streptomyces的含量，施加牛粪可提高土壤中Streptomyces和Promicromonospora的丰度。蔬菜(生菜)根内生菌中的多样性大于叶内生菌多样性，粪肥施用对根内生菌中微生物组成影响较大。施用粪肥处理中有13种ARGs易迁移至蔬菜(生菜)根与叶中，分别为oleC、patA、msbA、macB、mdtB、mtrA、vanRO、liaR、gyrB、murA、tetW、strA和strB。此外，应用宏基因组学对比分析长期施用有机粪肥与无机肥对土壤抗性组的影响，发现施用有机粪肥后土壤中富集了15种ARGs，一些ARGs如sul1、sul2、tetX 和 tetL 等可能源自有机肥，而其他ARGs如 vanR、tcmA、rosB 和 mexF 可能来自土著菌，重金属、pH与营养的协同作用对土壤中ARGs的变化起主要作用。相关成果发表研究论文7篇，其中第一或通讯作者SCI4篇、EI2篇，分别发表在Chemosphere等环境微生物领域权威期刊上。项目成果揭示了ARGs在菜田系统中的分布特征，阐明了粪肥中易迁移的ARGs种类，明确了影响ARGs迁移的关键理化及生物因素，为揭示菜田系统中ARGs的传播机制、评估其生态健康风险奠定了理论基础。