MRP1/MRP2-GSH 在睾丸细胞铅转运中的作用研究

铅（Pb）跨膜转运出组织细胞是其解毒行为的关键因素。Pb多以离子/分子模拟方式介导进入细胞，但细胞内铅再借用哪些介质外排尚未见明确报道。多药耐药相关蛋白（MRP）是细胞内外源化学物与GSH 形成的共轭体"外排泵"，文献分析和前期研究结果提示MRP可能参与GSH-Pb复合体外排。本项目拟建立支持-精原细胞体外非接触式共培养体系模拟在体环境，在控制实验条件下，采用相关抑制剂、激活剂、siRNA干扰等技术手段，探讨MRP1、MRP2表达量及GSH含量变化对Pb转运的影响；同时辅助整体动物实验，借用SRXRF技术和免疫组织化学技术等，观察MRP1/2表达与Pb在睾丸组织细胞中的精细分布关系；辅助人群调查，分析铅暴露人群MRP1、MRP2及GSH水平与精子质量的关系；进而阐明MRP-GSH 在睾丸细胞铅转运中的作用。该结果将为合理加快铅的代谢、排泄，进一步促进生殖健康提供理论据 。

铅（Pb）跨膜转运出组织细胞是其解毒行为的关键因素。多药耐药相关蛋白（MRP）是细胞内外源化学物与GSH 形成的共轭体“外排泵”，文献分析和前期研究结果提示MRP可能参与GSH-Pb复合体外排。本课题研究过程中，对已发表有关铅对男性生殖健康影响的文献进行Meta分析显示:铅引起阳痿率和早泄率的升高，精子总数的减少，精子畸形率的上升和精子活动率的下降。以低浓度铅长期慢性作用于实验大鼠，结果显示随着铅染毒剂量的增加，大鼠睾丸组织铅含量增高，GST活力与GSH含量下降，Nrf2和MRP1的表达均呈现上升趋势。通过同源建模等相关技术构建了小鼠的MRP1蛋白质三维结构模型，并基于分子对接筛选ZINC生物合成小分子库中内含的全部化合物，结果中发现GSH与MRP1蛋白具有较强的结合力。通过慢病毒干扰技术成功构建了低表达MRP1的小鼠睾丸支持细胞株（TM4-sh细胞）。体外细胞学结果显示铅能够诱导TM4细胞中MRP1 mRNA和蛋白表达水平以及MRP1转运活性的改变。TM4-sh细胞中的铅蓄积量较TM4细胞中高出2到8倍。以20μM醋酸铅分别处理TM4和TM4-sh细胞24小时后，更换为无铅培养基继续培养0-12小时。收集各时间点细胞检测细胞内铅残留量，结果显示更换为无铅培养基1小时后，TM4-sh细胞内仍然残留有75.0%的铅，较同时间点TM4细胞铅高出41.8%。在随后的3、6、9h时点，TM4-sh细胞内持续显示含有较高的铅残留量，且较TM4细胞平均高出23.4%，各时点差异均有统计学意义，P＜0.05。同样以20μM醋酸铅处理TM4细胞24h后，更换含MRP特殊抑制剂MK571的无铅培养基继续培养0-12小时，MK571组在第3-12小时各点细胞内铅的相对残留量均高于对照组(P<0.05)。可见敲低或抑制MRP1的表达水平和转运活性能够显著增加铅在细胞中的蓄积，延缓细胞中铅的外排。进一步分析显示TM4细胞中铅外排依赖于ATP，并与GSH和GST有关。该研究成果将有助于预防和治疗铅对雄性生殖系统的损伤。因动物实验显示铅对刚断乳大鼠睾丸有一定影响，本研究对纳入388篇文献分析了1996年以来中国儿童血铅变化趋势和调查了1047名武汉市儿童血铅现状，结果显示儿童血铅平均水平和铅中毒率随时间在降低，但与2012年美国更新的血铅标准比仍然较高。控制铅暴露仍然是当前重要工作之一。