适用于活体细胞功能研究的光纤化荧光光谱显微成像

Confirming actual cell functions in vivo is the key of unlocking life's secrets and conquering diseases at cellular level. Fluorescent spectral microscopic imaging technology enables to observe multi-cell events relevant to cell functions simultaneously. This technology is one of the important technical means for visualizing the intravital study of cell function. However, current fluorescent spectral microscopic imaging technology is only achieved under conventional microscopy by invasive means, which limits the application range of this technology in the intravital study of cell functions. The emerging fiber-based fluorescent spectral microscopic imaging technology makes it possible to overcome the difficulty. To satisfy the need of the intravital study of cell function, the fiber-based fluorescent spectral microscopic imaging technology remains to be studied in detail for obtaining the spectral imaging information of fluoresecnt signals accurately. In this proposal we aim to develop a noval fiber bundle-based fluorescent spectral microscopic imaging method, and apply it to the intravital study of cell function: building a Fourier transform fluorescent spectral microscopic imaging technology based on optical fiber bundle, characterizing the propagation of fluorescent signals in the fiber bundle-based fluorescent spectral microscopic imaging system, developing the imaging aberration theory of fluorescent spectral microscopic imaging based on fiber bundle, and carrying out fluorescent spectral microscopic imaging experiments in vivo for the intravital study of cell function. The successful implement of this proposal will provide a novel study platform for the visualization of the intravital research of cell functions and the new experimental basis and scientific confirmations for explaining and predicting cell functions reasonably.

在活体条件下确证细胞的真实功能是从细胞水平揭开生命奥秘、征服疾病的关键。荧光光谱显微成像技术能够对细胞功能相关的多细胞事件进行并行探测，是活体细胞功能研究可视化的重要技术手段之一。但现有荧光光谱显微成像技术仅能在显微镜下以有创方式实现，局限了其在活体细胞功能研究中的应用。光纤化荧光光谱显微成像技术的出现为解决这一问题提供了可能。在准确获取荧光信号光谱成像信息方面，光纤化荧光光谱显微成像技术还有待深入研究，以更好满足活体细胞功能研究的需要。本项目提出适用于活体细胞功能研究的光纤化荧光光谱显微成像新方法：建立基于光纤束的傅里叶变换荧光光谱显微成像技术；研究荧光信号在光纤化荧光光谱显微成像系统中的传输机制；探索光纤化荧光光谱显微成像系统的成像理论；开展细胞功能研究的活体光谱成像实验。该项目的顺利实施将为活体细胞功能研究的可视化提供新的实验平台，为合理解释、预测细胞功能提供新的实验依据和科学依据。

摘要：..光纤化荧光光谱显微成像技术为活体细胞功能研究可视化提供了重要的技术手段。但在准确获取荧光信号光谱成像信息方面，光纤化荧光光谱显微成像技术还有待深入研究，以更好地满足活体细胞功能研究的需要。本项目建立了适用于活体细胞功能研究的光纤化荧光光谱显微成像新方法，从基本原理验证、核心器件设计、典型应用示范等几个方面展开了一系列的工作。为了提高光纤化荧光光谱显微成像技术的光谱分辨率，以荧光发射光谱为特征量，建立了基于光纤束的傅里叶变换荧光发射光谱显微成像技术，实现了横向分辨率4.4μm，最高光谱分辨率在632.8nm处0.2nm。极大地提高了光纤化荧光光谱显微成像技术的光谱分辨能力，而且还具有成像通量大、光谱连续、分辨率可调等优点，为活体辨别不同标记的多细胞事件提供了技术支撑。在此基础上，为了进一步改善光纤化荧光光谱显微成像技术的信噪比，以荧光激发光谱为特征量，建立了基于光纤束的傅里叶变换荧光激发光谱显微成像技术。该方法将光谱调制机制引入照明光路，从而避免了在探测光路因插入额外元器件带来的信号下降。实现了横向分辨率3.48μm，最高光谱分辨率在488nm处0.2nm的系统性能。该技术具有样品光辐射小、并行荧光激发探测、可变光谱分辨率及自校准等优点。微型物镜是光纤化荧光光谱显微成像的关键器件，其光学性能决定了系统最终实现的成像质量。由于微型物镜外形尺寸小，光谱成像又要求其具有良好的消色差性能，因此，设计难度较大。本项目分三步走，逐步摸索经验、改进设计、缩小外径并最终实现了5片透镜组成的微型物镜，外径2.6mm，物方数值孔径0.5，视场360μm，横向分辨率0.78μm，成像质量与商业共聚焦显微镜类似。利用所建立的荧光光谱显微成像新方法，在体原位观察了小鼠皮肤、鼠脑内不同类型神经细胞以及神经元与血管网络等模型，为该方法的生物学应用摸索了经验。其中，首次实现了利用光纤化方法在小鼠脑内对不同类型神经细胞的同时观察与光谱分辨。该项目的顺利实施，为活体细胞功能研究可视化提供了新的工具。