乳腺癌细胞基因组内G-四链体的形成特征及调节因素研究

G-quadruplexes regulate the expression of genes involved in oncogenesis. Currently, gaps still exist regarding our knowledge for the features of G-quadruplex formation in the genome of breast cancer cells and its regulatory factors. Based on previous studies, we hypothesized that the landscapes of G-quadruplex formation in the promoters of cancer-regulatory genes in breast cancer cells are different from these in normal mammary epithelial cells; physiological conditions, microenvironmental factors and certain natural compounds may affect G-quadruplex formation and consequently regulate gene expression. This project has three specific aims. In Aim 1, we will use chromatin immunoprecipitation (ChIP) to map the regions of G-quadruplex formation in the genomes of normal mammary epithelial cells and breast cancer cells, and determine the G-quadruplex formation difference between these two cell lines. In addition, we will use the RNA-seq technique to determine the transcriptomes of these two cell lines, and individually correlate the G-quadruplex formation sections and transcription regions in each cell line. In Aim 2, we will investigate the effects of microenvironmental and physiological factors, including hypoxia and pH changes, on G-quadruplex formation and oncogene expression in breast cancer cells. In Aim 3, we will carry out in vitro assays to screen for natural compounds that can either stabilize G-quadruplex structures or inhibit the activities of helicases with that can resolve G-quadruplexes. Overall, this project will systematically characterize G-quadruplex formation in the genome of breast cancer cells, and determine the effects of physiological conditions, microenvironmental factors and natural compounds on G-quadruplex formation. The achievements of this project will provide theoretical insights to the clinical treatment of breast cancer patients.

G-四链体控制癌变功能基因的表达，但乳腺癌细胞基因组G-四链体形成特征及调节因素的研究还很匮乏。我们基于以往研究提出假想：乳腺癌细胞中癌变调节基因启动子的G-四链体形成不同于正常细胞；微环境和生理条件及某些天然化合物可以影响G-四链体形成来调节基因表达。本项目有三个研究目标：1. 用染色质免疫共沉淀法鉴定和比较正常乳腺细胞及乳腺癌细胞基因组中G-四链体的分布，并对应转录组数据以发现G-四链体形成与基因表达相关性。2. 研究微环境及生理因素（缺氧和pH值改变）对乳腺癌细胞基因组G-四链体形成及原癌基因表达影响，分析二者对应关系。3. 利用体外实验筛选出能够稳定G-四链体结构或抑制其解旋酶活性的天然化合物，并研究对细胞内G-四链体形成影响及抑癌活性。本项目将系统性地阐明乳腺癌细胞基因组G-四链体的形成特征，研究调节G-四链体形成的微环境及生理因素和天然化合物，为乳腺癌病人临床治疗提供理论依据。

G-四链体能够调控癌变基因表达，但乳腺癌细胞基因组G-四链体的特征及调节因素的研究还未知。本项目的假想是：乳腺癌细胞中形成的调节启动子活性的G-四链体不同于正常乳腺细胞；微环境、生理条件及某些天然化合物可以影响G-四链体形成来调节基因表达。在项目执行过程中，目标1的研究内容被其他研究者发表，无继续执行的必要性。因此，我们在完成目标2和3的同时，进行了其他与G-四链体相关的研究。主要内容包括：1. 低氧条件培养的细胞VEGFA升高，HIF1α下降，其它多个癌基因未发生变化，pH对G-四链体形成及相关基因表达的影响未发现明显规律和可重复性。2. 克隆解旋酶PIF1, FANCJ 和 WRN的编码区，并进行原核表达，但这些分离纯化后的重组蛋白未展现出解旋酶活性。3. 创立iFRET-M方法，筛选小分子化合物库中的1500种化合物，获得8种G-四链体天然化合物配体，其中部分分子具有抑制乳腺癌活性。4. 研究了RNA中G-四链体对BCL2前体RNA可变剪接的调节作用，发现G-四链体能够调节BCL2α和β剪接异构体的比例。5. 揭示了G-四链体通过与SP1结合调节AKT1基因表达。6. 鉴定了YY1通过结合HYOU1启动子中G-四链体对该基因表达的调节作用。7. 利用生物信息学方法，对G-四链体在启动子区域的分布以及对基因表达调节的进行了全基因组的系统研究。8. 创新性揭示了G-四链体调节转录因子MAZ相分离的研究。1）在CCND1启动子区域的G-四链体能够结合并招募转录因子MAZ；2）G-四链体能够促进MAZ相分离的gel-to-liquid 转化；3）G-四链体主要发挥了激活原癌基因表达的作用；4）MAZ与G-四链体的结合以及形成相分离的能力对MAZ促癌作用是必要的。本项目执行期间，项目负责人共发表19篇致谢本项目资助的SCI论文。本项目全面地研究了G-四链体对多种基因的调节作用，初步揭示了G-四链体形成受微环境、生理因素和天然化合物调节的现象，创新性发现了G-四链体对转录因子MAZ相分离的调节作用，为将G-四链体作为潜在靶点进行癌症治疗提供了重要的理论依据。