出芽短梗霉菌除草活性化合物分离鉴定及除草机理研究

The environmental harmony pesticides have become the inevitable trend of contemporary pesticides development, one of the important ways of green pesticide research is screening active substances or pesticides lead compounds from natural compounds. Aureobasidium pullulans was an important weed pathogenic fungi which has broad spectrum herbicidal activity to Chenopodium album L, Galium aparine L．et al, which has shown development potential for fungi herbicide. This study intends to explore the optimism culture media of Aureobasidium pullulans, isolation and purification of toxin and herbicidal mechanism. A method for obtaining a large number of Aureobasidium pullulans mycotoxin was developed, and a set of technical system for the isolation and extraction of the toxin was established.

环境和谐型绿色农药成为当代农药发展的必然趋势，从天然化合物中筛选农药活性物质或农药先导化合物是绿色农药研发的重要途径。出芽短梗霉是近来研究发现的对阔叶杂草猪殃殃、藜等杂草具有显著除草活性的一种重要杂草病原真菌，该菌株具有发展为真菌除草剂的潜力。本研究拟通过对出芽短梗霉进行产毒培养基优化、毒素提取分离及除草机理研究，筛选出一种获取大量出芽短梗霉毒素的培养方法，形成一套分离提取出芽短梗霉毒素的技术体系，并明确出芽短梗霉毒素的除草机理。

随着化学除草剂使用量和使用年数的增加，面临诸如抗药性、环境污染等问题。因此，人们急需研制高效、低毒、环保的生物除草剂用于代替部分化学除草剂。近年来，利用杂草病原真菌产生的对杂草具有毒性作用的天然产物即真菌毒素，开发生物源除草剂或新颖除草剂的先导化合物，已成为生物除草剂研究的热点之一。本项目对出芽短梗霉菌PA-2的产毒培养基优化、毒素提取分离及除草机理进行了研究。以PA-2菌株产孢量为检测指标，采用单因子优化PA-2菌株发酵培养基和最佳发酵条件，通过中心组合设计筛选培养基成分最佳配比；用PA-2可湿性粉剂用于藜防除试验。经优化后，产孢最佳培养基配方为葡萄糖84.60 g/L、大豆粉46.35g/L、NaCl 2.59g/L、MgSO4 0.52g/L、KCl 0.78g/L、K2HPO4 6.50g/L、(NH4)2SO4 0.52g/L；最佳发酵条件为pH7、温度25℃、装液量60 mL/250mL、转速180r/min、接种量8%、培养时间120h。PA-2可湿性粉剂在田间对藜的鲜重防效达75.0%。采用色谱学的方法，从PA-2发酵产物中分离纯化出2个具有除草活性的单体化合物，分别为奥洛奎宁和短梗霉素，对野燕麦种子胚芽/根的IC50分别46.4/19.8µg/mL和35.2/14.4µg/mL。出芽短梗霉菌对藜和野燕麦叶片的生理生化影响试验发现叶绿素、可溶性蛋白质、可溶性糖含量以及苯丙氨酸解氨酶活性呈现总体下调趋势，在接种第3d，观察到藜细胞内叶绿体形状畸形，胞内结构不完整、外膜逐渐解体。从对叶片组织的代谢物影响来看，处理后24h后，共筛选到185个具有显著差异（VIP>1，P<0.05）的代谢产物，其中有148个上调，37个下调，腺苷和甜菜碱可以作为24h后的主要生物标志物。KEGG通路富集分析发现，这些差异代谢物主要富集在全局和概述地图、氨基酸代谢、碳水化合物代谢通路等3条代谢通路中。叶片中嘌呤代谢、次级代谢产物生物合成、氨基酸代谢和碳水化合物代谢变化可能是 PA-2侵染藜的主要机制。菌株PA-2全基因组序列全长28.9Mbp，平均GC含量为50%，共编码10839个基因，预测到该菌株具有4个已知的次级代谢产物合成基因簇，编码Melanin、Burnettramic Acid A、ACR-Toxin I、Abscisic Acid。