单核细胞增生李斯特菌感染过程中NLRP3炎症复合体形成机制的研究

单核细胞增生李斯特菌（LM）溶血素O（LLO）诱导宿主产生IL-18，继而激活细胞免疫应答。炎症复合体是活化胱天蛋白酶（caspase）-1，产生IL-18所必需的平台，申请人研究发现LM感染过程中NLRP（NACHT， LRR and PYD containing proteins）3炎症复合体被激活。因此，LLO可能激活NLRP3炎症复合体。预实验表明syk和JNK激活NLRP3炎症复合体，促进IL-18分泌。本课题拟利用westernblot比较LLO表达和非表达菌株感染小鼠细胞后syk和JNK磷酸化水平;用其他NLRP3刺激原刺激syk 和JNK抑制剂处理的细胞，检测IL-18和荧光显微镜观察炎症复合体的形成，阐明syk，JNK是启动NLRP3炎症复合体形成的关键，这将为理解LM的致病机理及宿主的免疫应答，研究该病及其他胞内感染性疾病甚至肿瘤的治疗及基因工程疫苗奠定基础。

本项目首先利用syk酪氨酸激酶以及其他几种细胞内常见的信号蛋白激酶（包括JNK、p38MAPK，PI3K）抑制剂预处理小鼠腹腔渗出液巨噬细胞，检测野生型单核细胞增生性李斯特菌（LM）感染后上清液中IL-18蛋白水平的变化，探讨syk等多种蛋白激酶在LM感染过程中可能发挥的作用，筛选出LM感染过程中发挥作用的蛋白激酶为JNK，syk。LM感染过程中，ASC依赖的炎症复合体是介导IL-18生成的必需分子平台，为了进一步明确syk和JNK蛋白在LM感染过程中作用，利用syk和JNK蛋白抑制剂预处理小鼠腹腔渗出液巨噬细胞，感染LM后，用荧光显微镜检测ASC依赖的炎症复合体的形成情况，我们的结果表明syk和JNK参与调控ASC依赖的炎症复合体的活化，进而介导IL-18的成熟与分泌；另一方面，实验组前期结果显示LLO毒力因子参与IL-18的生成，说明LLO可能参与炎症复合体的活化；为进一步明确LLO和炎症复合体的作用关系，本实验比较野生型LM，LLO缺失菌株以及LLO恢复菌株感染过程中syk和JNK蛋白激酶的表达水平，以及syk和JNK抑制剂预处理后ASC依赖的炎症复合体的形成情况，同时利用ATP刺激小鼠腹腔渗出液巨噬细胞，观察JNK和syk调控NLRP3炎症复合体的形成以及IL-18的表达，结果表明syk信号通路特异性地调控LM感染过程中LLO介导的ASC-依赖的炎症复合体的活化。而JNK非特异性地参与此过程。研究成果总结如下：.1.syk信号通路及JNK信号通路通过调控单增李斯特菌感染过程中炎症复合体的活化，进而调节IL-18的成熟与分泌。.2.在李斯特菌感染过程中，syk和JNK的蛋白磷酸化水平与毒力因子LLO密切相关。.3.syk信号通路特异性地调控李斯特菌感染过程中炎症复合体的活化，而JNK信号通路非特异性参与ASC-依赖的NLRP3以及AIM2炎症复合体的形成。