Tat系统功能缺失影响霍乱弧菌生物膜及环境适应能力的机制研究

Vibrio cholerae is the causative agent of lethal diarrhea and successful survival of Vibrio cholerae in aquatic environment is believe to be the main reason of seasonal and pandemic outbreaks worldwide.Understanding the survival mechanism of Vibrio cholerae in natural environment is therefore of great importance for disease prevention. Biofilm has been proposed to constitute an environmental refuge for a number of bacterial pathogens and to provide pathogens with an adaptive advantage promoting their environmental persistence,while the mechanism of biofilm formation is not clear. In previous study,we identified a functional Non-Sec dependent(Tat) transport system from V.cholera and found it was correlated with biofilm formation and contributed to the pathogenicity and environmental survival of the bacteria.To clarifying the underlying mechanisms,in this study, We will first identify the key genes and substrates for biofilm formation by exploiting methods of metabonomics and transcriptomics. Then, the role of Tat transportation system during biofilm formation will be investigated by using methods of substrates analysis, gene deletion,inserted inactivation or over expression. This will provide new and fundamental clues for the pathogenicity and prevention study of Vibrio cholerae in future. By elucidating the contribution of Tat transportation system to the environmental survival, we will get deep insight into the transmission/pathogenicity mechanism of vibrio cholera and provide new clues for its prevention.

霍乱弧菌是致死性腹泻霍乱的病原体，可造成季节性暴发和世界性的大流行。霍乱弧菌在水环境中的生存是造成暴发流行的主要因素之一，因此霍乱弧菌的环境生存机制一直备受关注。生物膜形成是细菌抵抗外环境压力的主要方式之一，而目前对霍乱弧菌形成生物膜的机制尚不清楚。本课题的前期研究提示，霍乱弧菌具有功能性的Tat转运系统，并与其形成生物膜及Rugose菌落等环境生存因素相关。本课题拟通过代谢组学和转录组学等方法，比较Tat基因缺失株和野毒株的代谢差异，研究与生物膜形成相关的关键基因和代谢物，并通过Tat底物试验、基因缺失、基因插入失活、强启动子上调表达、动物模型等方法，对相关基因进行功能验证，确定生物膜形成能力等表型变化与Tat转运系统的关系，阐述Tat系统在霍乱弧菌外界生存中的作用。本课题研究结果将为霍乱弧菌的致病机制研究和霍乱的预防治疗工作提供重要的理论依据。

霍乱弧菌是致死性腹泻霍乱的病原体，可造成季节性暴发和世界性的大流行。霍乱弧菌在水环境中的生存是造成暴发流行的主要因素之一，因此霍乱弧菌的环境生存机制一直备受关注。.双精氨酸转位系统(简称Tat系统)与经典的Sec运输系统明显不同，运输底物为完全折叠蛋白质并结合一定的氧化还原因子，Tat系统底物蛋白在序列上的一个明显的特点是其N端信号肽存在有一保守的双精氨酸结构域（S/T-R-R-x-F-L-K）。目前，已经陆续在大肠杆菌、幽门螺旋杆菌、耶尔森氏鼠疫杆菌、伤寒沙门菌、葡萄球菌等细菌的染色体中发现或根据序列推测到了Tat系统主要基因的存在。El Tor霍乱弧菌染色体上有TatABC 操纵子和TatE 基因。.我们针对野生株、缺失株和回补株的一些表型的测定，同时对乳鼠和HT-29的粘附定居能力、生物膜的形成、CT的分泌、褶皱型菌落的形成等指标的测定和比较，确定Tat系统与霍乱致病性相关。同时，为了进一步确定Tat基因簇各个基因的功能和其功能最小单位的确定。我们做了各基因的共转录分析。.外膜完整性测定和菌落第1、6、16天的转录组水平测定发现，Tat基因组确实未导致外膜完整性损伤，褶皱型菌落的形成应与Tat转运系统有关。基因芯片结果提示，除了与微生物生存和新陈代谢有关的基因转录发生改变，与转运和结合蛋白有关的基因转录水平也发生了改变。因此，我们推断的褶皱型菌落是细菌对营养缺乏环境的代偿机制外，Tat转运系统的功能破坏可能也在其中起到了一定的作用。.为了发现更多与Tat系统有关的底物蛋白和酶，本项目利用 Biolog 公司的自动微生物鉴定仪的表型芯片技术，对突变株和野生株进行代谢检测。N16961与N169-dtat在72小时后的图谱对比发现，N16961能利用的碳源要多于N169-dtat。生长利用有差异的两个碳源，即精氨酸和天门东氨酸可能是与tat系统有关的两个碳源。.研究证实褶皱型菌落、生物膜形成能力等表型变化与 Tat 转运系统有直接关系，阐述了Tat系统在霍乱弧菌外界生存中的作用。本课题研究结果将为霍乱弧菌的致病机制研究和霍乱的预防治疗工作提供重要的理论依据。