替莫唑胺诱导下胶质瘤干细胞DNA修复功能的研究

脑胶质瘤是神经系统发病率最高的恶性肿瘤，对化疗存在着复杂的耐药机制。MGMT和MMR是两种最常见的细胞DNA修复机制，在烷化剂化疗引起的肿瘤细胞DNA损伤的修复中起着极其重要的作用。在烷化剂诱导下，肿瘤细胞DNA修复机制的变化在使肿瘤产生耐药的同时，也可能为肿瘤复发提供了条件。本研究拟以原发和复发胶质母细胞瘤中的胶质瘤干细胞为研究对象，采用PCR和免疫组织化学等分子生物性方法来检测MGMT和MMR基因启动区甲基化状态及其蛋白表达，通过体外不同剂量替莫唑胺来诱导两种来源的胶质瘤干细胞进行更新和分化，综合分析替莫唑胺在胶质瘤干细胞原代与分化过程中，对MGMT和MMR基因表达的影响，阐明烷化剂与胶质瘤干细胞DNA修复功能的关系，进一步揭示烷化剂的耐药机制以及MGMT和MMR基因表达调控与胶质瘤发生、发展的关系，为指导脑胶质瘤的个体化化疗和预测肿瘤复发提供理论依据。

【摘要】 目的 研究替莫唑胺（temozolomide，TMZ）在治疗脑胶质瘤过程中，胶质瘤干细胞（Glioma Stem Cells,GSC）O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）和错配修复系统（mismatch repair system，MMR）中主要成员hMLH1和hMSH2基因启动区甲基化情况以及它们与胶质瘤干细胞替莫唑胺耐药的相关性。 方法 通过悬浮培养法，从脑胶质瘤细胞系U251、A172和SHG-44中分离胶质瘤干细胞株U251g、A172g和SHG-44g。免疫荧光技术检测GSC的CD133、Nestin和GFAP的表达。通过细胞毒性试验计算U251g和A172g的半数抑制浓度（IC50），再以其对应的IC50、150%IC50两种浓度分别对U251g和A172g进行诱导培养，CCK-8法检测诱导前后GSC对替莫唑胺的敏感性。甲基化特异性PCR（MSP）和Western blot分别检测TMZ诱导前后hMLH1、hMSH2和MGMT基因启动区甲基化情况和相应蛋白表达情况。 结果 （1）从脑胶质瘤细胞系U251、A172和SHG-44中成功分离胶质瘤干细胞株U251g、A172g和SHG-44g，并通过鉴定符合肿瘤干细胞的定义。（2）U251g的IC50为1695.41μmol/L，对TMZ不敏感；A172g的IC50为724.63μmol/L，对TMZ中度敏感。IC50、150%IC50两种浓度对U251g和A172g诱导培养后对应U251g-1、U251g-2和A172g-1、A172g-2，各自IC50为1913μmol/L（不敏感）、2555μmol/L（不敏感）和754μmol/L（中度敏感）、1549μmol/L（不敏感）。（3）TMZ诱导后，胶质瘤干细胞hMLH1基因启动区出现异常甲基化，且甲基化水平随药物浓度的增加而增高，同时对应的蛋白表达缺失；hMSH2基因启动区未发现甲基化，蛋白表达正常；MGMT基因启动区出现去甲基化并蛋白表达阳性。 结论 TMZ在治疗脑胶质瘤过程中，可引起胶质瘤干细胞DNA修复系统功能的异常，从而导致胶质瘤的复发和耐药性增加。