普通小麦籽粒过氧化物酶活性基因克隆、表达机理分析及功能标记开发

Flour color is an important trait in the assessment of flour quality and exerts significant influence on the qualities of Chinese noodles, steamed bread and other products. Peroxidase (POD) activity in grain is an important factor determining the color of ?our and end-use products of wheat. In the present study, an F6 recombinant inbred line (RIL) population derived from the Sunstate/Zhoumai 18 cross will be used to map QTLs for POD activity. The POD genes will be cloned by the method of in silico cloning in combination with PCR amplification, and the functional markers will be developed for the genes according to their allelic varants among different wheat cultivars, which will be validated with the RIL population and 250 Chinese winter wheat cultivars. The expressions of POD genes during grain development will be analyzed by real-time PCR (RT-PCR) and Western Blotting, and the gene function will be studied by TILLING. This study will provide useful information about the molecular mechanism of POD gene expression and its association with wheat quality, and functional markers for the improvement of POD activities in wheat breeding.

面粉颜色是决定小麦品质的重要指标，对面条、馒头等面制品品质有重要影响。籽粒过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性是影响面粉和面制品颜色的重要因素。本研究拟通过选用Sunstate/周麦18 F6重组自交系群体和250份中国冬小麦主栽品种，进行POD活性的QTL分析；应用同源克隆结合PCR验证的方法，克隆与颜色性状紧密相关的POD基因并分析其在不同品种中的等位变异，根据各等位基因之间的序列差异开发基因的功能标记，并分析基因型与表型之间的关系；利用实时定量PCR和Western Boltting技术分析籽粒不同发育时期POD位点不同等位基因的表达模式，利用TILLING技术验证小麦过氧化物酶活性基因的功能。研究结果将为分子标记辅助选择快速改良过氧化物酶活性提供有效的功能标记，揭示POD基因的分子机理，最终为开展小麦过氧化物酶活性基因分子生物学研究和面粉颜色改良提供科学依据。

在豆麦/石 4185 RIL群体中共检测到 3 个 QTL，QPod.caas-3AL、QPod.caas-4BS 和QPod.caas-5AS，分别位于3AL、4BS 和 5AS 上。QPod.caas-3AL、QPod.caas-4BS和 QPod.caas-5AS在不同环境下能分别解释5.3-9.2%、9.3-21.2%和 5.8-11.7%的表型变异。基于全基因组关联分析，检测到176个分布于21个染色体区域（-log10 (P) ≥3.0）与POD活性显著相关的SNP，单个SNP 可以解释7.8-23.2%的表型变异。在显著相关的SNP 位点区域内发现6个候选基因。利用同源克隆的方法克隆了普通小麦3A、3B、7A、4A 和7D染色体上 POD基因的全长编码序列，分别命名为TaPod-A1、TaPod-B1、TaPod-A2、TaPod-A3 和TaPod-D1。在 TaPod-A1基因点发现两个等位变异，命名为TaPod-A1a和TaPod-A1b，并据此开发了一对显性互补的功能标记POD-3A1和POD-3A2，具有TaPod-A1a 的材料与低 POD 活性相关，而TaPod-A1b 型的材料与高POD活性相关；在 TaPod-D1基因点发现两个等位变异，命名为TaPod-D1a和TaPod-D1b，并开发了一对显性互补的功能标记POD-7D1和POD-7D6，具有TaPod-D1b 的材料与低 POD 活性相关，而TaPod-D1a 型的材料与高POD活性相关。同时，用基于TaPod-A1和TaPod-D1两个基因位点开发的两对显性互补的标记相结合，进一步对冬小麦材料进行检测，显著提高了标记的选择效率，用TaPod-A1b/TaPod-D1a更能有效选择高POD活性的材料。采用半定量RT-PCR技术对TaPod-A1基因的时空表达模式进行了分析，TaPod-A1基因在籽粒中特异表达，且在开花后14-28天表达水平最高，随着籽粒成熟表达水平迅速降低。在籽粒发育过程中，TaPod-A1b等位基因品种的基因表达水平高于TaPod-A1a等位基因品种。TaPod-A基因表达模式分析表明，TaPod-A1b基因在开花后7天籽粒发育时期有较高转录表达水平，随之降至低水平稳定表达。