miR160在形成层活动周期调控中的作用机制研究

In this study, a reliable experimental system was established in which the dormancy of poplar could be induced or released artificially. Based on this system, the small RNA deep sequencing technique was used to analyze the differentially expressed miRNA during the dormancy-activation transition of cambium. An interesting finding was that miR160, which involved in the auxin signal pathway, peaked significantly in ecodormancy. Anatomy、molecular biology and plant physiology methods will be used together to investigate how miR160 and its target genes involve to regulate cambium annual cycle transition though auxin signal. This will reveal the molecular mechanism of cambial activity cycle regulation from multiple levels, which will also provide a theoretical basis for forest production and breeding on trees with high yield and quality.

本研究以毛白杨为实验材料，建立了人工诱导形成层活动周期转变的实验体系。通过小RNA高通量测序，获得了在毛白杨形成层活动周期各个阶段形成层区域差异表达的microRNA，从中筛选出参与生长素信号通路并且在被动休眠期特异性表达的miR160进行研究。利用生物信息学、分子生物学、植物生理学等研究手段，探讨miR160及其靶基因如何通过生长素参与控制形成层活动周期，以期从多个层次揭示形成层活动周期调控的分子机理，并对指导林业生产，为优质高产树种的定向选育提供理论依据。

以杨树（Populusalba ×Populusglandulosa）为材料，建立了人工诱导休眠和休眠解除的实验体系，分别在活动期、生理休眠期和被动休眠期刮取杨树形成层细胞区域材料，对其中的miRNAs进行了第二代高通量测序, 系统地研究了在形成层休眠维持和解除过程中具有显著性表达差异的miRNAs。研究结果显示：123个已知miRNAs和34个新的miRNAs表达值在形成层活动周期中具有显著的表达差异。其中，参与生长素信号通路的miR160家族特异性地在被动休眠期表达，并且克隆了miR160的靶基因AUXIN RESPOND FACTORS(ARF)家族成员基因，荧光定量PCR实验表明其表达模式与miR160不完全相反，因此推测ARF基因在形成层活动周期中的变化主要受转录水平调控。同时验证了miR169的表达模式，并对其靶基因Nuclear Factor Y subunit A（NFYA）家族成员PagHAP2.6进行了功能研究，结果显示：PagHAP2.6基因是酵母HAP2的同源基因，在转录水平受ABA诱导，它在形成层活动期中能被Pag-miR169剪切。过表达PagHAP2.6基因的转基因拟南芥比野生型耐受ABA诱导的叶片衰老。在本氏烟草（Nicotianabenthamiana）叶片中的瞬时表达实验表明Pag-miR169a能够通过剪切PagHAP2.6基因来降低其对ABA的抵抗作用。本研究系统研究了miRNAs在形成层休眠维持和解除过程中的表达模式变化，重点分析了杨树miR160和miR169家族及其靶基因的表达模式和功能，为研究miRNAs在转录后水平调控形成层休眠维持和解除过程提供了新的思路，并为进一步寻找在形成层活动周期中起重要作用的靶基因提供了丰富的信息。