转录因子OsERF3介导的水稻抗虫机理研究

Our previous studies have shown that OsERF3, a repressor type ERF transcriptional factor, is a central early herbivore-responsive component that is located upstream of defense-related signaling pathways and plays an important role in rice defense responses and herbivore resistance. To elucidate how OsERF3 regulates the signaling pathways and thus shapes rice defense responses and herbivore resistance, we, in this project, will isolate the interacting proteins of OsERF3 by combining yeast two-hybrid system, bimolecular fluorescence complementation and so on. Afterwards, the subcelluar location and induced expression patterns of the interacting protein genes will be investigated, and the homozygous mutants with silencing or overexpresing one of the interacting protein genes will be obtained by using Agrobacterium-mediated transformation system, followed by GUS staining-based screening. Moreover, mutants whose two or more genes are mutated will be bred by intercrossing mutants with single mutation, which are from those already existed in our lab and created in this study. The defense-related MAPK activity, signaling signature, defense-related chemical and transcriptional profiling, as well as herbivore resistance of the mutants stated as above will be analyzed by combination of molecular biology, chemical analysis, transcriptome, metabolome and bioassay methods. We will also investigate the interaction network among OsERF3, interacting proteins and defense-related signaling pathways. This comprehensive analysis will provide new insights into the mechanism responsible for rice herbivore resistance mediated by OsERF3 and will provide resistance genes for crop breeding.

以我们前期鉴定的一个水稻诱导抗虫反应中的重要早期调控因子OsERF3为研究切入点，利用酵母双杂交、双分子荧光互补等方法，分离鉴定OsERF3上下游的重要互作因子；利用荧光显微技术和定量PCR，分析这些互作因子在细胞内的分布部位及其诱导表达特征；利用反向遗传学方法，获得抑制或过量表达上述一个互作因子基因的水稻纯合突变体，并通过突变体间杂交（结合利用我们已有的其他突变体），获得相关的2个或多个基因突变体；利用基因组学、代谢组学、分子生物学、化学分析以及生物测定等研究方法，比较上述相关突变体与正常水稻在虫害胁迫下防御相关MAPK活性、信号分子含量、转录组、防御化合物指纹图以及抗虫性等的差异；分析OsERF3、互作因子及相关信号途径间的上下游关系；从而深入揭示OsERF3介导的水稻抗虫反应机理，获得具有自主知识产权的水稻重要抗虫功能基因，为水稻抗性品种的培育与合理利用提供重要的理论与技术指导。

本项目以我们前期鉴定的一个水稻诱导抗虫反应中的重要早期调控因子OsERF3为研究切入点，鉴定了10多个OsERF3上下游调控元件及其互作因子，并对其中的多个重要调控元件和互作因子在水稻诱导抗虫反应中的作用开展了研究。研究发现作用于OsERF3上游的调控元件OsLRR-RLK1，可能是水稻识别二化螟为害信号的一个受体，它可以正调控二化螟为害诱导的水稻JA、JA-Ile和乙烯的生物合成，从而激活水稻对二化螟的抗性。上游元件OsMPK20-5反向调控OsERF3的转录水平，降低褐飞虱产卵诱导的乙烯和NO含量，从而阻止水稻因过度防御而产生的自毒。沉默OsLRR-RLK2降低OsERF3转录水平及OsMPK6组成型活性、改变转录因子OsWRKY30、OsWRKY13和OsWRKY89转录水平，导致褐飞虱为害诱导的JA、JA-Ile和ET含量下降、SA和H2O2含量上升，并增强对稻飞虱的抗性。分析了2个OsERF3下游元件OsWRKY70和OsWRKY53在调控水稻防御反应中的作用，发现OsWRKY70能激活JA的生物合成，但同时抑制GAs的合成，从而在协调植物生长与防御中发挥重要作用；OsWRKY53是OsMPK3/OsMPK6的一个负反馈调节子，它可以通过抑制早期防御反应的信号途径，控制植物防御投资的过度。揭示了OsERF3的3个互作因子，Os-28、OsHC03和OsHC13可以分别通过发挥E3泛素连接酶作用、调控防御相关信号途径等影响水稻的防御反应。研究结果为OsERF3介导的水稻抗虫反应提供了一幅比较清晰的作用机理图，不仅深入揭示了水稻诱导抗虫反应的机理，而且获得了具有自主知识产权的水稻重要抗虫功能基因，为水稻抗性品种的培育与合理利用提供了重要的理论与技术指导。