胰腺癌起源于胰腺导管细胞与骨髓间充质干细胞融合细胞的实验研究

现有研究认为恶性肿瘤起源于肿瘤干细胞（TSCs），但TSCs来源尚存争论。因恶性肿瘤与其发生器官组织结构相似，有研究者提出TSCs源于肿瘤发生器官原位干细胞；但TSCs在分子表达、迁移能力等方面却与骨髓间充质干细胞（bMSCs）相似，也有研究者认为TSCs源于bMSCs。鉴于bMSCs可与器官原位细胞融合参与损伤组织的修复，且TSCs同时具备器官原位细胞与bMSCs的生物学特性，我们推测TSCs可能源于器官原位细胞和bMSCs的融合细胞。项目组将胰腺导管细胞与bMSCs离体融合，发现融合细胞部分生物学特性与TSCs接近，且易形成非整倍体细胞。本课题拟通过在体实验验证TSCs源于胰腺导管细胞与bMSCs的融合细胞，并通过离体实验明确融合细胞恶性转化能力、恶性转化过程及恶性转化融合细胞的生物学特征。本项目将为恶性肿瘤起源的新理论提供实验支持，并为其防治研究提供理论依据。

本项目通过建立GFP转基因小鼠骨髓移植-DMBA/TPA诱导胰腺癌模型，研究模型中所获得肿瘤细胞的来源，通过流式细胞技术分选GFP+肿瘤细胞并且鉴定其生物学特性，确定骨髓间充质干细胞与胰腺导管细胞均参与胰腺癌起源。在体外建立成熟稳定的骨髓间充质干细胞与器官原位成体干细胞的融合、筛选、纯化的技术体系，通过该体系获得高纯度的融合细胞并且通过RT-PCR、免疫荧光共聚焦技术检测其细胞表面标志物的表达，鉴定其增值、分化能力以明确其生物学特征。采用RT-PCR，Western blot及免疫细胞化学技术明确融合细胞是否较胰腺导管细胞更容易发生恶性转化，以及融合细胞恶性转化过程中的分子事件，是否发生P53、K-ras等基因突变，确定该融合细胞即为胰腺癌干细胞。除此之外，在本项目的资助下，通过建立胰腺损伤修复动物模型，采用免疫组织化学技术和免疫荧光共聚焦技术，确定骨髓间充质干细胞在损伤胰腺中的分布和组织分化情况，采用RT-PCR技术明确miR-9与骨髓间充质干细胞修复胰腺损伤的关系。采用蛙皮素腹腔注射法建立小鼠慢性胰腺炎动物模型，尾静脉注射GFP+小鼠骨髓间充质干细胞，HE、天狼星红染色法及免疫荧光共聚焦染色法确定骨髓间充质干细胞参与胰腺纤维化的形成过程，并且通过表达相应关键分子减轻胰腺纤维化。采用建立DMBA/TPA诱导胰腺癌小鼠动物型，尾静脉注射GFP+小鼠骨髓间充质干细胞法，研究骨髓间充质干细胞参与胰腺癌的发展过程，通过免疫组织化学技术和免疫荧光共聚焦技术确定骨髓间充质干细胞迁移至肿瘤组织中并且分化成为肿瘤实质细胞和间质细胞。通过三年的持续研究，我们基本完成胰腺癌起源于骨髓间充质干细胞与胰腺导管细胞的融合细胞的假设证明，为恶性肿瘤起源的新理论提供新的实验支持，同时基本明确了骨髓间充质干细胞在胰腺损伤、慢性胰腺炎和胰腺肿瘤中所扮演的角色，为临床转化医学提供理论和实验依据。