ATRX/DAXX/H3.3基因突变在端粒延长替代机制和肿瘤发生中的作用研究

ATRX/DAXX/H3.3 protein complex plays important roles in heterochromatin maintenance and gene transcription regulation. Frequent mutations in ATRX/DAXX/H3.3 were identified in pancreatic neuroendocrine tumors and pediatric glioblastoma. These mutations had a perfect correlation with alternative lengthening of telomere (ALT). However, whether or not these mutations could lead to activation of ALT and tumorgenesis is still unknown, and there is no effective therapy targeting these mutations. In this project, we plan to introduce ATRX/DAXX/H3.3 mutations into different cell models using CRISPR/Cas9 gene editing technology in order to mimic ATRX/DAXX/H3.3 mutations in tumor patients. Using these cell models, we will try to investigate the oncogenic roles of these mutations and their roles in activating ALT and to identify the synthetic lethal partners of these mutations. The results of this study may provide novel insights into cancer therapy in tumor patients with ATRX/DAXX/H3.3 mutations.

ATRX/DAXX/H3.3蛋白复合物在异染色质结构维护和基因转录调控中发挥重要作用。在胰腺神经内分泌瘤和胶质瘤中，存在高频ATRX/DAXX/H3.3突变，并且这些突变与端粒延长替代机制(ALT)有密切的相关性。但是这些突变导致的功能缺失是否能够激活ALT，导致肿瘤发生尚属未知，也缺乏针对突变肿瘤的有效靶向治疗手段。本项目拟运用CRISPR/Cas9技术在基因组水平对ATRX/DAXX/H3.3基因进行单独或联合编辑，通过模拟体内ATRX/DAXX/H3.3基因突变导致的功能缺失，研究ATRX/DAXX/H3.3基因突变的致瘤性和这些突变导致的功能缺失是否可以激活ALT。在此基础上，利用CRISPR/Cas9 sgRNA文库筛选和高通量测序技术寻找和鉴定ATRX/DAXX/H3.3基因突变的合成致死基因，为ATRX/DAXX/H3.3基因突变肿瘤的靶向治疗提供分子靶点。

ATRX/DAXX/H3.3蛋白复合物在异染色质结构维护和基因转录调控中发挥重要作用。在胰腺神经内分泌瘤和胶质瘤中，存在高频ATRX/DAXX/H3.3突变，并且这些突变与端粒延长替代机制(ALT)有密切的相关性。但是这些突变导致的功能缺失是否能够激活ALT，导致肿瘤发生尚属未知，也缺乏针对突变肿瘤的有效靶向治疗手段。. 本项目运用CRISPR/Cas9技术在基因组水平对ATRX基因进行编辑，研究ATRX基因突变导致的功能缺失是否可以激活ALT。在此基础上，利用CRISPR/Cas9 sgRNA文库筛选和高通量测序技术寻找和鉴定ATRX基因突变的合成致死基因。. 利用CRISPR/Cas9技术我们在肝癌细胞系PLC/PRF/5中成功敲除了ATRX基因，通过APB染色未检测到ATRX缺失的PLC/PRF/5细胞产生ALT表型。在ATRX敲除和配对的ATRX野生型PLC/PRF/5细胞系中，我们通过全基因组范围的CRISPR基因敲除筛选，鉴定出了58个ATRX合并致死的候选基因。这些基因主要参与mRNA加工、有丝分裂、染色质重塑和细胞周期调节。我们选取了筛选结果中排名靠前的WEE1、VCP和PKMYT1，通过RNAi技术进一步验证了这些基因与ATRX缺失的合并致死效应。在19个参与细胞周期调节的候选基因中，WEE1是唯一一个有小分子抑制剂并且处于临床实验的候选基因。分别用不同剂量的WEE1抑制剂AZD1775分别处理ATRX WT和KO的PLC/PRF/5细胞3天，结果发现ATRX KO的PLC/PRF/5细胞对WEE1抑制剂AZD1775更加敏感（IC50: 1.65μM vs 0.38μM，ATRX WT vs ATRX KO）。其他相关研究由我们的合作者焦宇辰研究组完成。. ATRX合并致死基因WEE1的鉴定，为ATRX突变肿瘤的治疗提供了新的靶点；其他候选的合并致死基因也可能为ATRX突变肿瘤的治疗提供有效的靶点。