NEDD4-1泛素化CNrasGEF调控脑胶质瘤细胞增殖/凋亡及侵袭的机制研究

我们既往研究发现泛素连接酶NEDD4-1可促进胶质瘤细胞的增殖与侵袭，但机制不明。CNrasGEF含有与NEDD4-1结合的PY基元，但在脑胶质瘤细胞中是否被NEDD4-1泛素化及下游效应分子尚不清楚。.本项目以脑胶质瘤标本与培养的U251和U87细胞为研究对象，采用分子生物学、免疫沉淀、蛋白质沉降及免疫印迹等方法，研究NEDD4-1与CNrasGEF的相互作用及对CNrasGEF的泛素化作用，检测NEDD4-1对CNrasGEF下游分子Rap1活性、ERK活性及细胞膜上N-cadherin水平的影响；最后检测NEDD4-1对胶质瘤细胞的增殖与侵袭作用是否依赖CNrasGEF。最终阐明一条NEDD4-1通过泛素化CNrasGEF，抑制Rap1的激活，解除对ERK的抑制，促进细胞增生；破坏N-cadherin介导的细胞间粘附作用，促进细胞侵袭的新的信号通路，为胶质瘤的治疗提供新的靶点。

近年来，蛋白的泛素化降解在肿瘤发生机制中的作用越来越受到人们的重视，泛素连接酶NEDD4-1 (Neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated 4-1)是研究热点之一。研究发现NEDD4-1通过泛素化修饰，促进多种蛋白的降解，从而在肿瘤的生长中起着重要作用。但是关于NEDD4-1对肿瘤细胞迁移/侵袭中的作用及机制却鲜有报道。. 本项目以脑胶质瘤标本与培养的U251和U87细胞为研究对象，采用分子生物学、免疫组化、免疫沉淀及免疫印迹等方法，研究NEDD4-1在脑胶质瘤发生发展中的作用，并探讨其机制。我们的研究发现，NEDD4-1可通过泛素化CNrasGEF(Cyclic nucleotide Ras guanine nucleotide exchange factor)来调控脑胶质瘤细胞的侵袭与迁移。具体结果如下：（1）过表达NEDD4-1促进脑胶质瘤细胞的侵袭与迁移，下调NEDD4-1表达产生相反的作用；而NEDD4-1并不影响脑胶质瘤细胞的增殖与凋亡。（2）NEDD4-1可与CNrasGEF结合，多泛素化降解CNrasGEF。（3）下调CNrasGEF的表达增强了脑胶质瘤细胞的侵袭与迁移，而过表达CNrasGEF则抑制了脑胶质瘤细胞的侵袭与迁移，与NEDD4-1的作用相反。（4）下调CNrasGEF的表达增强了NEDD4-1对脑胶质瘤细胞侵袭与迁移的促进作用。（5）在脑胶质瘤临床标本中检测显示，脑胶质瘤中NEDD4-1的mRNA水平较非肿瘤脑组织高， CNrasGEF的mRNA水平与非肿瘤脑组织相比无明显差异，亦与NEDD4-1的mRNA水平无相关性；而NEDD4-1的蛋白水平较非肿瘤脑组织高，CNrasGEF的蛋白水平较非肿瘤脑组织低，与NEDD4-1的水平呈相反的变化，具有明显的相关性。以上研究提示NEDD4-1通过泛素化CNrasGEF，促进细胞侵袭与迁移，为进一步研究脑胶质瘤中泛素连接酶的作用提供新的理论依据。